2017, Vol. 37
在许多生理和病理条件下，如细胞内缺血缺氧、糖基化受阻、钙代谢障碍等都会诱导未折叠蛋白 (unfolded protein response, UPR) 或错误折叠蛋白在内质网腔内蓄积、细胞内钙稳态失衡，引发未折叠蛋白反应的激活，导致内质网应激 (endoplasmic reticulum stress ERS)[1-3]。葡萄糖调节蛋白78(GRP78) 是细胞为了适应ERS产生的一类蛋白，与热休克蛋白有较高的同源性，其生成现已被认为是ERS应答启动的一个标志。既往研究显示内质网应激通路与人直肠癌[4]、甲状腺癌[5]等恶性肿瘤的放射敏感性密切相关，但具体机制尚未明确。本研究以人头颈部鳞癌细胞系 (KB、Fadu、Detroit 562) 为细胞模型，观察照射后ERS核心蛋白GRP78的活化并检测ERS通路特异性抑制剂Salubrinal对射线调控头颈鳞癌细胞增殖的影响, 旨在明确ERS通路参与调控人头颈部鳞癌细胞放射敏感性。
材料与方法1.材料:MEM、RPMI 1640培养基和胎牛血清购买于美国GIBCO公司。ERS抑制剂Salubrinal (sal)、DMSO、RIPA裂解液购自于美国Sigma公司。兔抗人β-肌动蛋白、GRP78多克隆抗体购自于美国Cell Signaling公司。吉姆萨染色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western blot实验相关试剂购买于中国碧云天生物科技公司。
2.细胞培养:3种头颈部鳞癌细胞 (KB细胞系、Fadu细胞系、Detroit 562细胞系) 购买于上海中国科学院细胞库。KB、Detroit 562(De) 细胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基、Fadu用含有10%胎牛血清的MEM培养基在37℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，2~3 d传代1次，选择对数生长期细胞进行实验。
3.Western blot实验检测人头颈部鳞癌细胞中GRP78的表达情况: 25 ml的培养瓶接种细胞，细胞生长至对数期时，应用德国西门子直线加速器X射线进行照射，源靶距为100 cm, 剂量率为300 cGy/min, 吸收剂量为4 Gy，于照射后不同时间点 (0、20 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h) 收取细胞。按参考文献[6]的方法检测GRP78蛋白的表达情况。用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，参照BCA蛋白检测试剂盒说明书检测蛋白浓度后，用8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转移法转至PVDF膜上，用5%BSA封闭后，进行一抗GRP78 4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h, 洗涤后采用放射自显影技术进行蛋白条带的显影，获得各条带的吸光度 (A) 值。以相应蛋白条带的平均吸光度值与β-肌动蛋白吸光度值的比值表示各组蛋白表达水平，进行统计学分析。另将3种细胞系设立空白对照组和ERS通路抑制剂 (Salburinal) 组 (sal组)，以预实验所得Salubrinal的浓度 (10 mmol/L) 于细胞生长至对数状态时处理3种细胞，以同样的方法检测GRP78蛋白的相对表达量。
4.克隆形成实验检测Salubrinal对细胞集落克隆形成的影响:接 种细胞于6孔细胞培养板，细胞贴壁后，以10 mmol/L Salubrinal浓度预处理细胞。将3种细胞分别设立单纯照射组、给药后12 h+照射组、给药后24 h+照射组和给药后36 h+照射组，分别给予0、2、4和6 Gy X射线照射细胞，10~14 d后终止培养，弃上清，用预冷磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤2次，置4%多聚甲醛中固定细胞10 min。弃固定液，以吉姆萨染色液于室温染色10~30 min，以超纯水缓慢洗去染色液，置室温下干燥，拍照计数。计算细胞存活分数，采用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，计算出D0值，进而求出放疗增敏比 (SER)。SER=(单纯照射组D0值与给药+照射组D0值之比)。细胞集落形成率 (PE)=集落数/细胞接种数×100%，细胞存活率 (SF)=某一剂量照射实验组的克隆数/(该组细胞种指数×PE)
5.统计学处理:所有实验均重复3次，结果以x±s表示。应用SPSS 13.0软件进行数据分析，组间比较正态性检验符合正态分布采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1.射线对人头颈部鳞癌细胞GRP78表达的影响:采用Western blot法检测ERS核心蛋白GRP78的表达发现，GRP78在3种头颈部鳞癌细胞系中均有表达。与0 min组相比，GRP78表达在照射后20 min~1 h开始增加，3 h达到高峰，随后表达逐渐减少，KB细胞表现尤为明显，见图 1。在照射后3 h时，KB细胞、Fadu细胞及De细胞中的GRP78表达水平分别为1.07±0.06、1.03±0.06和0.87±0.05，较各自0 min组的0.56±0.03、0.47±0.04和0.07±0.05均有明显升高，差异有统计学意义 (t=12.72、13、37、18.31，P < 0.05)。
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图 1 蛋白印迹法检测射线照射后不同时间点3种细胞中GRP78的表达情况A. GRP78的蛋白条带；B. GRP78的相对表达量 注：a与0 min组比较，t=12.72、13、37、18.31，P＜0.05 Figure 1 Expression of ERS core protein GRP78 at different time after radiation A. Protein images of Western blotting assay; B. Relative level of GRP78 expressions in three kinds of HNSCC. |
2. Salubrinal对人头颈部鳞癌细胞GRP78表达的影响：Western blot检测ERS特异性抑制剂Salubrinal对GRP78表达的影响发现，KB、Fuda和De 3种细胞sal组GRP78的表达较空白对照组明显减少，见图 2。sal组KB细胞、Fadu细胞及De细胞中GRP78表达水平分别为0.32±0.05、0.41±0.06及0.78±0.06，分别较空白对照组的0.87±0.04、0.65±0.04及0.92±0.04明显下降，两组比较差异有统计学意义 (t=14.25、5.34、3.12，P < 0.05)。
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图 2 蛋白印迹法检测Salubrinal处理后ERS核心蛋白GRP78的表达情况A. GRP78的蛋白条带; B. GRP78的相对表达量 注：a与空白对照组比较，t=14.25、5.34、3.12，P＜0.05 Figure 2 Expression of the core protein GRP78 of ERS after treatment of cells with Salubrinal A. Protein images of Western blotting assay; B. Relative level of GRP78 expressions. |
3. ERS抑制剂Salubrinal对人头颈部鳞癌细胞集落克隆形成的影响：集落克隆形成实验发现，Salburinal作用不同时间 (12、24和36 h) 后，给药+照射组头颈部鳞癌细胞细胞存活分数明显低于单纯照射组，见图 3。采用单击多靶模型拟合后，计算细胞平均致死量D0及放射增敏比 (SER)，结果提示，Salubrinal作用12 h后照射，3种细胞的D0值由1.69、1.51和1.92降低为1.45、1.43和1.82，放射增敏比分别为1.16、1.05和1.06，随着作用时间延长，SER值增大 (表 1)。提示Salburinal对KB、Fadu及De 3种头颈部鳞癌细胞具有放射增敏效应，且增敏效应与Salburinal具有时间相关性。
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图 3 不同剂量照射对10 mmol/L Salburinal处理后不同时间头颈部鳞癌3种细胞存活分数的影响A.KB细胞；B.Fadu细胞; C.De细胞 Figure 3 Survival curves of three kind of cells HNSCC irradiated with X-rays. The cells were treated with 10 mmol/LSalburinal at different time before irradiation A.KB; B.Fadu; C.De |
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表 1 各处理组3种细胞单击多靶模型拟合的生物学参数及增敏比 Table 1 Stimulation parameters of the survival curves of three kind of cells and SER of drug treatment. The survival curve was fitted with the Multi-target-single hitting model |
讨论
内质网是真核细胞内重要的膜结合性细胞器，具有重要的生理功能[7]。在多种情况下，都会诱导未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内蓄积，引起内质网的应激[8](ERS)。研究表明，ERS不仅在正常细胞中存在，也参与肿瘤细胞的发生发展[9]，并与肿瘤细胞的浸润、转移等不良预后相关[10-12]。GRP78作为ERS核心蛋白参与肿瘤细胞的微血管形成、转移过程[13-14]。本实验研究发现ERS同样存在于头颈部鳞癌细胞中。射线照射3种细胞系GRP78表达增高，提示射线诱导肿瘤细胞产生ERS并活化其核心蛋白GRP78。
Salubrinal是Boyce课题组通过药物筛选发现小分子去磷酸化的抑制剂，能够对抗ERS引起的不良反应[15]，具有保护神经组织[16]和心肌组织[17]的作用。近年Salubrinal在肿瘤细胞综合治疗研究中得到了广泛关注。多项研究表明，Salubrinal联合中药或化学物质在膀胱癌[18]、胆囊癌[19]、卵巢癌[20]等多种肿瘤细胞中通过增加细胞凋亡、诱导细胞自噬以及线粒体功能障碍等多种机制，抑制肿瘤细胞的增殖，提高肿瘤细胞对药物的敏感性[19]。本研究中发现，Salubrinal作为ERS抑制剂联合射线照射肿瘤细胞抑制细胞增殖，降低细胞存活率。作用机制可能与Salubrinal抑制ERS对肿瘤细胞保护作用，降低肿瘤细胞放射抗拒从而提高肿瘤细胞的放射敏感性相关。另有研究发现，Salubrinal联合射线治疗提高软骨肉瘤的放射敏感性，且与Salubrinal浓度相关[21]。
本实验从ERS通路与放射治疗的相关性着手，探讨ERS抑制剂Salubrinal调控头颈部鳞癌放射敏感性，为提高头颈部鳞癌放射敏感性研究提供方向，并为ERS通路靶向药物的研究提供了实验基础。但ERS参与调控肿瘤辐射抗拒作用机制有待进一步研究。
利益冲突 本人与本人家属、其他研究者，未因进行该研究而接受任何不正当的职务或财务利益，在此对研究的独立性和科学性予以保证。与其他作者以及基金无任何利益冲突作者贡献声明 孙超南设计研究方案，收集数据后统计并起草论文；乔俏监督指导实验进行；李光指导审定并修改论文；韩楚阳协助细胞培养与预处理实验；韩凝协助蛋白印记检测实验；张妙协助细胞克隆形成实验及拍照处理
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