目前组织间内照射作为治疗非小细胞肺癌(NSCLC)一种辅助性手段，特别是对于经传统放化疗效果不佳、反复复发或心肺功能较差的患者，该方法更是一种较好的选择^[1]。1971年，Folkman^[2]首次提出肿瘤生长和转移有赖于新生血管生成，抗血管生成能有效遏制肿瘤生长，逐渐成为肿瘤研究的热点。乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)在体内显著增加无氧酵解和促进实体瘤内微血管的生成, 是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)最重要的调控因素。本研究利用A549人肺腺癌细胞系建立肺癌裸鼠模型，在移植瘤内植入不同活度¹²⁵Ⅰ粒子，观察¹²⁵Ⅰ粒子组织间内照射对肿瘤血管生成的影响以及瘤体中VEGF和HIF-1α表达的变化，探讨¹²⁵Ⅰ粒子植入治疗肺癌的生物学机制，为临床更好地使用¹²⁵Ⅰ粒子植入治疗肿瘤提供理论依据。

1.实验动物及材料：雌性BALB/c-nu小鼠24只，无特殊病原体(SPF)级，4~6周龄，体重16~18 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[合格证号：SCXK (京)2014-0004]，饲养于青岛大学医学院动物实验中心SPF级动物房，适应实验室环境1周后用于实验；A549人肺腺癌细胞系购自美国菌种保藏中心(美国ATCC公司)；放射性¹²⁵Ⅰ粒子及空源粒子由北京智博高科生物技术有限公司提供，放射性活度为22.2、29.6和0 MBq (空源粒子)3种，半衰期59.43 d。

2.裸鼠皮下移植瘤模型的建立及处理：A549细胞系，加入含10%胎牛血清、RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)，置于37℃、5%CO₂培养箱(美国Forma公司)中培养，待细胞铺满80%~90%即传代。取对数生长期细胞，用RPMI 1640培养液调节细胞浓度至1×10⁷/ml，用注射器取0.2 ml细胞悬液接种到裸鼠右背部近头侧皮下。隔日观察移植瘤生长情况，记录成瘤时间。每4 d用游标卡尺测量移植瘤大小，按公式V=L×W²/2(L为最长径，W为与L相垂直的横径)计算移植瘤体积。接种24 d后，当移植瘤平均体积为(300±50) mm³时，采用随机数字表法将24只荷瘤裸鼠分为4组，每组6只，0、22.2、29.6 MBq组和对照组(0 MBq组植入放射活度为0的空源粒子，对照组未作处理)。75%乙醇消毒移植瘤部位皮肤后，用18 G植入针和粒子枪在移植瘤边缘5 mm处将粒子植入瘤体中心部位，每个移植瘤植入粒子1枚。对照组不做任何处理。植入30 d后处死裸鼠，剥取瘤体做后续检测。绘制肿瘤生长曲线，比较各照射组抑瘤情况。

3.免疫组织化学染色检测瘤组织中微血管密度(microvascular density, MVD)：取0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小的瘤组织用4%多聚甲醛(北京碧云天生物技术有限公司)固定，24 h后石蜡包埋，4 μm切片。CD34淋巴细胞抗原(lymphocyte antigen CD34, CD34)是标记血管内皮细胞的抗体，它的表达可以反映瘤组织MVD情况。按免疫组织化学SP法对CD34进行免疫化学分析。一抗为抗CD34的兔抗鼠单克隆抗体(1:100，英国Abcam公司)。脱蜡入水，修复抗原，滴加一抗，4℃过夜，PBS替代一抗为阴性对照。滴加生物素化二抗，DAB显色。采用Image-pro plus 6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)，在400高倍视野计数。

4. RT-PCR法检测瘤组织中VEGF和HIF-1α的mRNA表达：TRIzol法(美国Invitrogen公司)提取瘤组织RNA；按反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书进行cDNA合成。经GenBank查询基因序列，运用Primer Premier 3.0软件(加拿大Premier公司)设计引物：VEGF，上游引物：GGAGCGTTCACTGTGAGC，下游引物：GCGAGTCTGTGTTTTTGC；HIF-1α，上游引物：CTGGAAACGAGTGAAAGG，下游引物：ATGCTAAATCGGAGGGTA；内参：β-肌动蛋白，上游引物：GGCACCACACCTTCTAC，下游引物：CTGGGTCATCTTTTCAC。PCR反应体系为：2×SuperReal PreMix Plus 10 μl，上游引物0.6 μl，下游引物0.6 μl，cDNA 100 ng，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，RNase-Free ddH₂O至20 μl；反应条件：95℃预变性15 min；95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共40个循环；PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

5. Western blot法检测瘤组织中VEGF和HIF-1α的蛋白表达：将瘤组织加入裂解液超声粉碎，12 000×g，20 min离心。按BCA试剂盒说明书的方法测定蛋白浓度(北京碧云天生物技术有限公司)。等量蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，经兔抗鼠VEGF抗体、HIF-1α抗体(1:1 000，英国Abcam公司)4℃孵育过夜，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1:10 000，天津康为世纪生物技术有限公司)室温孵育1 h，ECL化学发光试剂(北京碧云天生物技术有限公司)显影检测VEGF和HIF-1α抗原。

6.结果判定：瘤组织的MVD检测参照Maeda等^[3]标准，低倍镜(×40)下全面观察CD34染色的阳性血管，除外微血管稀少地硬化区、邻近良性组织的区域，选取肿瘤MVD最高及热点区域。随后在高倍视野(×400)下随机选取5个高MVD区域，计数MVC，求其平均值计算MVD (MVD=MVC/面积，每400倍视野面积为0.188 5 mm²，单位个微血管/mm²)。统计微血管的标准：单个的可与周围血管、肿瘤细胞和其他结缔组织区分的棕染内皮细胞或内皮细胞团，均可计数为一个微血管，无论是否形成管腔；肌层较厚或管腔直径＞8个红细胞直径的血管均不计数。mRNA相对表达量运用ABI7500软件(美国应用生物系统公司)进行分析，采用2^-ΔΔCt法。蛋白表达的半定量分析选用Image J软件(美国国立卫生研究院)。

7.统计学处理：数据用x±s表示。采用SPSS 22.0软件进行分析。方差齐性检验后，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，相关性采用Spearman直线相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.裸鼠肺腺癌移植瘤动物模型：共计接种24只，全部顺利成瘤，成瘤率100%。裸鼠自荷瘤开始至取瘤，均存活，没有发现明显放射诱导损伤。植入粒子全部成功回收，储存在铅盒中进行安全处理。

2.粒子植入后的抑瘤效应：裸鼠接种细胞悬液后的移植瘤生长曲线见图 1。粒子植入后3周各组移植瘤体积比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，此后至治疗结束4个时间点，即第44、48、52和54天，各组移植瘤体积间比较差异均有统计学意义(F=10.720、20.083、56.081、62.297，P < 0.05)。治疗结束后粒子植入组瘤体积22.2 MBq组为(886±97) mm³、29.6 MBq组为(590±107) mm³，小于对照组的(2 297±149) mm³，差异有统计学意义(q=14.117、17.075，P＜0.05)；0 MBq组瘤体积为(1 779±276) mm³，与对照组差异均无统计学意义(P＞0.05)，22.2 MBq组与29.6 MBq组瘤体积相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)。表明22.2、29.6 MBq粒子植入组在治疗的第4~5周能有效抑制肿瘤生长。

图 1 24只裸鼠移植瘤生长曲线 注：与对照组比较，aq=5.462、7.842、13.067、14.117，P＜0.05；bq=6.875、9.536、15.906、17.075，P＜0.05 Figure 1 Growth curves of transplanted human lung adenocarcinoma in 24 nude mice

3.免疫组织化学SP法检测瘤组织的MVD：各组之间MVD差异有统计学意义(F=7.607，P < 0.05)，22.2 MBq组CD34阳性染色的MVD为522±119，29.6 MBq组为491±121，比对照组的922±260明显降低(q=4.826、5.197，P < 0.05)，而0 MBq组与对照组、22.2 MBq组与29.6 MBq组之间差异均无统计学意义(P＞0.05，图 2)

图 2 24只裸鼠移植瘤免疫组织化学CD34染色结果SP染色×400 A.对照组；B. 0 MBq组；C. 22.2 MBq组；D. 29.6 MBq组 注：箭头所示为CD34染色阳性血管 Figure 2 Immunohistochemical CD34-positive staining of tumor tissue slices SP×400 A. Control group; B. 0 MBq group; C. 22.2 MBq group; D. 22.2 MBq group

4.移植瘤中VEGF和HIF-1α的mRNA表达情况：RT-PCR检测表明，各组间VEGF和HIF-1α的mRNA的表达差异有统计学意义(F=101.058、59.014，P < 0.05)。22.2 MBq组和29.6 MBq组VEGF和HIF-1α的mRNA表达均明显下降，与对照组比较，差异有统计学意义(q_VEGF=18.881、17.211，q_HIF-1α=15.376、14.733，P＜0.05)。0 MBq组与对照组的VEGF和HIF-1α的mRNA表达差异均无统计学意义(P＞0.05)，22.2 MBq组与29.6 MBq组的VEGF和HIF-1α的mRNA表达差异均无统计学意义(P＞0.05，表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 24只裸鼠移植瘤VEGF和HIF-1α的mRNA相对表达量(x±s) Table 1 Relative expression levels of HIF-1α and VEGF mRNA in the transplanted tumors in 24 nude mice (x±s) 组别 只数 VEGF HIF-1α 对照组 6 1.000 1.000 0 MBq组 6 0.923±0.088 9 0.810±0.006 7 22.2 MBq组 6 0.279±0.065 9a 0.370±0.085 7a 29.6 MBq组 6 0.215±0.062 0a 0.278±0.065 1a  F值 101.058 59.014  P值 < 0.05 < 0.05 注：VEGF.血管内皮生长因子；HIF-1α.乏氧诱导因子-1α。a与对照组比较，q=18.881、17.211、15.376、14.733，P＜0.05

表 1 24只裸鼠移植瘤VEGF和HIF-1α的mRNA相对表达量(x±s) Table 1 Relative expression levels of HIF-1α and VEGF mRNA in the transplanted tumors in 24 nude mice (x±s)

5.移植瘤VEGF和HIF-1α蛋白表达：两种蛋白在各组移植瘤中的表达见图 3，各组之间差异均有统计学意义(F=11.400、15.530，P < 0.05)；22.2 MBq组与29.6 MBq组瘤组织VEGF和HIF-1α蛋白表达均明显减少，与对照组比较，差异有统计学意义(q_VEGF=5.848、6.263，q_HIF-1α=6.560、7.576，P＜0.05)，但0 MBq组与对照组的VEGF和HIF-1α蛋白表达差异均无统计学意义(P＞0.05)，22.2 MBq组和29.6 MBq组的VEGF和HIF-1α蛋白表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。

图 3 24只裸鼠移植瘤VEGF和HIF-1α的蛋白检测结果A.蛋白印迹法对各组VEGF和HIF-1α蛋白表达进行检测；B.各组VEGF/β-肌动蛋白、HIF-1α/β-肌动蛋白灰度值比较 注：1.对照组；2.0 MBq组；3.22.2 MBq组；4.29.6 MBq组 Figure 3 Protein expressions of HIF-1α and VEGF in the transplanted tumors in 24 nude mice A. Western blotting images of VEGF and HIF-1α proteins in each group; B. Semi-quantitative analysis of HIF-1α and VEGF protein band optical densities HIF-1α and VEGF level were normalized to corresponding β-actin level

6.裸鼠瘤组织中VEGF和HIF-1α的mRNA、蛋白表达的相关性：裸鼠瘤组织中VEGF和HIF-1α的mRNA表达均呈正相关关系(r=0.709，P < 0.05)；VEGF与HIF-1α蛋白表达正相关(r=1.000，P < 0.05)。这表明VEGF和HIF-1α的表达可能存在某种正相关关系。

早在1940年，放射性粒子植入就被用于治疗无法手术切除的NSCLC^[4]。与外放疗相比，¹²⁵Ⅰ粒子植入治疗持续低剂量照射，使乏氧细胞再氧合从而降低放射拮抗性，还有高度适形、并发症较少等特点。由于¹²⁵Ⅰ粒子植入突出的生物学优势，已越来越广泛的应用于前列腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌和头颈部恶性肿瘤等的治疗，并取得良好的治疗效果^[5-6]。目前对¹²⁵Ⅰ粒子植入治疗肿瘤的研究多集中于对肿瘤细胞凋亡的影响^[7-8]。本研究的创新处在于探讨¹²⁵Ⅰ粒子对肿瘤组织微血管的影响。

临床上应用的¹²⁵Ⅰ粒子放射活度为22.2~29.6 MBq，初始剂量率为7~8 cGy/h，生物等效剂量约为160 Gy^[9]。本研究采用22.2和29.6 MBq两种活度¹²⁵Ⅰ粒子及空源粒子分别种植于体积(300±50) mm³的人肺腺癌裸鼠移植瘤。结果发现植入治疗后3周各组移植瘤体积差异无统计学意义，但从第21天至第31天治疗结束22.2和29.6 MBq活度¹²⁵Ⅰ粒子植入均能减缓肿瘤增长，但两者比较差异无统计学意义。推测¹²⁵Ⅰ粒子初始剂量较低，并不能迅速使肿瘤出现生物效应，肿瘤组织水肿也可抵消部分抑瘤作用，不过¹²⁵I半衰期长，随着治疗时间延长，粒子植入引起的水肿消退而肿瘤吸收剂量增加，抑瘤效应显现出来。不同放射性粒子混合应用确保放疗效果的持续性，同时又有较高的初始放射剂量，值得后续探讨^[10]。

肿瘤微血管生成为肿瘤生长提供了必须的营养物质和氧气，同时也是肿瘤细胞侵袭、转移的必要条件^[11]。MVD已成为评估血管生成的“金标准”，既可反映血管生成程度，也可作为反映肺癌预后的独立指标^[12]。本研究应用可以反映瘤组织MVD情况的CD34标记血管内皮细胞，显示肿瘤微血管并对其进行定量分析，结果发现22.2和29.6 MBq组治疗后瘤组织的MVD明显降低，且两组瘤组织MVD的差异无统计学意义。表明¹²⁵Ⅰ粒子能显著抑制肿瘤微血管的形成。与Hu等^[13]实验结果一致。VEGF是目前已知最强、特异性最高的促血管生成因子，与肺癌的发生、转移和预后紧密相关；缺氧是促使肿瘤细胞生长、凋亡、转移等的关键因素，HIF-1α是肿瘤细胞适应缺氧微环境的中心环节，可上调多种靶基因的表达，促使肿瘤对相对缺氧的肿瘤微环境产生适应性改变^[14]。Koshikawa等^[15]研究显示，在转移性肺癌细胞中，HIF-1α还可上调其靶基因VEGF，诱导VEGF表达而促进肿瘤血管生成，成为肿瘤血管生成潜在的促进剂。倪嘉延等^[16]研究显示，在缺氧条件下，用构建的HIF-1α siRNA表达载体转染肝癌细胞，细胞中缺氧状态下诱导的VEGF表达显著减少。为探讨¹²⁵Ⅰ粒子抑制肺腺癌移植瘤微血管生成的机制，本研究结果显示，22.2和29.6MBq组VEGF与HIF-1α均较对照组降低，且呈正相关关系，初步证实¹²⁵Ⅰ粒子植入是通过抑制VEGF与HIF-1α的表达阻断微血管生成，两者发挥协同作用。有关VEGF与HIF-1α参与肿瘤微血管生成的机制可能为随着瘤体不断增大，血供不足而缺氧坏死，HIF-1α被诱导过度表达，进而HIF-1α下游重要的靶基因VEGF表达增强，从而激活一系列信号通路刺激血管生成；¹²⁵Ⅰ粒子放射治疗可阻断这一过程。

本实验通过构建人肺腺癌移植瘤动物模型，成功模拟了¹²⁵Ⅰ粒子对肺癌的治疗作用，初步证实¹²⁵Ⅰ粒子可以抑制肺腺癌移植瘤微血管生成，进而抑制肿瘤生长，具体机制与瘤组织VEGF和HIF-1α表达减少有关；对于具体信号通路的作用，将进一步研究，为¹²⁵Ⅰ粒子临床应用提供更坚实的理论依据。