电离辐射会导致外周血有形成分的变化，包括各类血细胞数量与质量的变化，其中淋巴细胞是放射敏感性最高的细胞之一^[1]，研究照射后外周血淋巴细胞的变化具有重要意义。另一方面辐射诱导的DNA损伤能够启动一系列复杂的反应以维持基因组的稳定性，利用基因芯片技术对辐射分子效应的研究尤其在寻找基因标志物方面已被广泛采用^[2-4]。本研究比较急性照射对比格犬外周血淋巴细胞基因表达谱的影响，选择低、中、高3个辐射损伤程度的剂量^{[1, 5]}，探讨其共同差异基因涉及的生物学功能及通路，以进一步增强对电离辐射生物效应分子机制的认识。

1.实验动物及饲养条件：雄性比格犬，20只，普通级，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：0020182，检疫30 d至11~12月龄，平均体重为8.16 kg。采用单纯随机数字表法均衡分为4组：空白对照组和0.5、2.0和5.0 Gy照射组，每组5只。动物饲养于中国辐射防护研究院药物安全性评价中心犬专用实验室，实验动物使用许可证号：SYXK (晋)2013-0002，室温保持在16~26℃，湿度40%~70%，换气次数8~10次/h，12 h照明，12 h黑暗，标准饲养笼具内喂养，每笼1只，每日清洁笼具1次，饲料采用北京科澳协力饲料有限公司生产的犬生长专用饲料。

2.辐射源：⁶⁰Co源，0.917 6 GBq，中国科学院刻度，位置与中心源平均距离为2.95 m，剂量率0.5 Gy/min。

3.外周血淋巴细胞分离及总RNA提取：照射后6 h，对每只动物经前肢头静脉采血5.0 ml，肝素抗凝，用等体积的D-Hanks液在无菌条件下稀释混匀，沿离心管壁加到等体积淋巴细胞分离液的液面上，以2 000 r/min，离心半径10 cm离心20 min。离心结束后，小心吸取第2层淋巴细胞层，并加等体积D-Hanks液，以2 000 r/min，离心半径10 cm再离心10 min，弃上清液，同样方法再重复洗涤1次。淋巴细胞总RNA的提取按照TRIzol试剂盒(美国Sigma公司)、纯化(德国Qiagen公司)说明书进行。

4.探针标记与杂交：样品总RNA利用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo公司)定量，并经Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)检测RNA完整性。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP (Cy3)标记的cRNA，标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C (美国Agilent公司)扫描得到原始图像。

5.芯片扫描和数据分析：采用Feature Extraction软件(Version 10.7.1.1, 美国Agilent公司)处理原始图像提取原始数据。再利用Genespring软件(Version 12.5，美国Agilent公司)进行分位数标准化和后续处理。利用倍数变化值进行差异基因筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0。然后利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7对差异基因进行基因本体论分析(GO分析)，以及京都基因与基因组百科数据库(KEGG)通路分析，对差异基因进行GO分析超几何分布关系分析，对每个有差异基因GO分析返回一个P值，P < 0.05表示差异基因在该GO中出现显著富集，KEGG通路分析亦对每个有差异基因存在的通路返回一个P值，P < 0.05表示差异基因在该通路中出现显著富集。

6. qRT-PCR验证：为验证芯片结果，以肌动蛋白-β(actin-beta，ACTB)为内参基因，选择差异表达基因凋亡增强核酸酶(apoptosis enhancing nuclease，AEN)和促分裂原活化蛋白激酶13(mitogen-activated protein kinase 13，MAP3K13)进行验证，引物序列见表 1。PCR扩增条件：95℃、10 min；95℃、10 s；60℃、30 s；40个循环。采用2^-ΔΔCt法，计算2条基因相对表达量，计算公式为：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因；ΔΔCt=ΔCt照射组样品-ΔCt对照组样品，相对表达量=2^-ΔΔCt，即2^-ΔΔCt=2^{-(ΔCt照射组样品-ΔCt对照组样品)}=2^{-ΔCt照射组样品}/2 ^{-ΔCt对照组样品}，比值＞1.00表示相对于对照样本该基因表达上调，比值＜1.00表示相对于对照样本该基因表达下调。

表 1(Table 1)

表 1 PCR扩增基因AEN和MAP3k13的引物序列 Table 1 PCR primer sequences of AEN, MAP3K13 genes 基因 引物序列 目的片段(bp) 凋亡增强核酸酶 F：5′ CATGGCGATGTCCTCTATG 3′ R：5′ GGAGCTTGAGGATCTCTTTC 3′ 142 促分裂原活化蛋白激酶13 F：5′ TGTACTGTCAGTGTGAACTTAG 3′ R：5′ TGGTCTGTGAGGATGGTAAC 3′ 120 肌动蛋白-β F：5′ GGCAGGTCATCACTATTGG 3′ R：5′ ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTT 3′ 115 注：AEN.凋亡增强核酸酶；MAP3K13.促分裂原活化蛋白激酶13

表 1 PCR扩增基因AEN和MAP3k13的引物序列 Table 1 PCR primer sequences of AEN, MAP3K13 genes

1.不同剂量组差异表达基因数目：照后6 h，与空白对照组相比较，0.5 Gy组差异表达基因共有1 621条，其中明显表达上调的有677条，明显表达下调的有944条；2.0 Gy组差异表达基因共有4 730条，其中明显表达上调的有2 147条，明显表达下调的有2 583条；5.0 Gy组差异表达基因共有6 899条，其中明显表达上调的有3 168条，明显表达下调的有3 731条。

2.3个剂量组共同差异表达基因：结果列于表 2和表 3。3个剂量组共同差异表达基因共308条，其中明显表达上调的有61条，明显表达下调的247条。上调倍数较大的包括C3、LOC475113、ICAM1、CORO6、GRIP2、TNK2、AEN和IRG1等，其中ICAM1在3个剂量组的上调倍数分别为2.47、7.71和12.17倍，均上调2倍以上，LOC475113基因在0.5 Gy组亦上调2.33倍，随剂量增大上调倍数增加，5.0 Gy组上调至20.72倍。下调基因包含CCAR1、CCNE1、嗅觉受体家族(cOR52X3、cOR52E17、cOR10A3)、MAP3K13、TEX9、TEX12、EBF1、GH1、GRTP1、SIRT1、SIRT4、SCAI、MAL、CSTA、CDO1和TP53BP1等，在3个剂量组均明显表达下调，其中GH1在0.5、2.0及5.0 Gy剂量组中差异表达倍数分别为2.9、23.5和101.2，MAP3K13在0.5、2.0及5.0 Gy剂量组中差异表达倍数分别为6.13、7.96和11.28，CDO1在0.5、2.0及5.0 Gy剂量组中差异表达倍数分别达到3.13、4.77和5.50。

表 2(Table 2)

表 2 3个剂量组照后共同表达上调基因 Table 2 The common up-regulated genes of three radiation groups 基因编码 基因名称 名称 上调a 0.5 Gy 2.0 Gy 5.0 Gy NM_001003291 ICAM1 intercellular adhesion molecule 1 2.47 7.71 12.17 XM_005633228 C3 complement component 3 4.14 7.11 16.87 NM_001256445 COR6D7 olfactory receptor family 6 subfamily D 2.46 12.20 19.77 XM_532343 LOC475113 lymphocyte antigen 6B-like 2.33 10.40 20.72 XM_005624893 CORO6 coronin 6 7.56 11.69 7.42 XM_541766 SYN2 synapsin Ⅱ 10.15 4.45 17.72 XM_005636464 RNF185 ring finger protein 185 2.11 2.73 5.92 XM_005637736 TCF7L2 transcription factor 7-like 2 2.14 2.98 2.80 NM_001003151 CXCR2 interleukin 8 receptor, beta 2.10 3.72 3.02 NM_001003308 SLC2A3 solute carrier family 2 (facilitated glucose) 0) transporter), member 3 2.06 2.43 3.11 XM_005631795 SLC7A11 solute carrier family 7 (anionic amino acid transporter light chain, xc-system), member 11 2.31 5.29 5.31 NM_001003311 SLC6A6 solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, taurine), member 6 2.07 2.40 3.29 NM_001284442 PLOD1 procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1 2.38 2.67 3.46 XM_005627451 GPR115 G protein-coupled receptor 115 4.54 5.46 3.51 NM_001024640 F3 coagulation factor ⅡI (thromboplastin, tissue factor) 2.09 2.48 3.55 XM_541697 HPN hepsin 2.38 4.46 3.76 XM_005638997 RIPK4 receptor-interacting serine-threonine kinase 4 2.73 4.21 3.77 XM_005634870 EBF4 early B-cell factor 4 2.35 2.47 4.12 XM_543017 SDC4 syndecan 4 2.02 2.44 4.22 NM_001287047 PTAFR platelet-activating factor receptor 2.18 3.05 4.26 XM_005624954 RAP1GAP2 RAP1 GTPase activating protein 2 2.07 2.22 4.28 XM_003432524 SGK1 serum/glucocorticoid regulated kinase 1 2.29 5.98 5.08 XM_005632109 GRIP2 glutamate receptor interacting protein 2 8.99 7.13 5.51 XM_540897 CHRM1 cholinergic receptor, muscarinic 1 2.09 4.49 5.95 NM_001003219 MMP9 matrix metallopeptidase 2.82 4.90 6.06 XM_539472 GPNMB glycoprotein (transmembrane) nmb 2.63 2.02 6.08 XM_853456 TNK2 tyrosine kinase, non-receptor, 2 2.12 5.68 6.69 XM_542615 IRG1 immunoresponsive 1 homolog (mouse) 2.81 5.39 6.78 XM_005636153 HCAR3 hydroxycarboxylic acid receptor 3 2.53 4.52 8.49 XM_545846 AEN apoptosis enhancing nuclease 5.36 8.52 8.70 XM_005622328 LAMB3 laminin, beta 3 2.01 4.71 10.18 注:a各组均与空白对照组相比

表 2 3个剂量组照后共同表达上调基因 Table 2 The common up-regulated genes of three radiation groups

表 3(Table 3)

表 3 3个剂量组照后共同表达下调基因 Table 3 The common down-regulation genes of three radiation groups 基因编码 基因名称 基因定义 下调a 0.5 Gy 2.0 Gy 5.0 Gy XM_844617 AK8 adenylate kinase 8 -2.68 -2.93 -3.80 NM_001082420 ALDH3A1 aldehyde dehydrogenase 3 family, member A1 -3.38 -8.54 -16.73 XM_534094 ANO3 anoctamin 3 -4.78 -20.88 -21.29 XM_005636895 CACNB3 calcium channel, voltage-dependent, beta 3 subunit -9.67 -9.50 -9.71 XM_536372 CCAR1 cell division cycle and apoptosis regulator 1 -2.47 -2.07 -3.37 XM_005616902 CCNE1 cyclin E1 -2.24 -2.97 -4.48 XM_862798 CD22 CD22 molecule -2.22 -5.81 -5.52 XM_538717 CD72 CD72 molecule -3.66 -7.08 -6.14 XM_531867 CDO1 cysteine dioxygenase type 1 -3.13 -4.77 -5.50 XM_005620727 CMTR2 cap methyltransferase 2 -36.24 -35.29 -13.54 NM_001017439 cOR10A3 cOR10A3 olfactory receptor family 10 subfamily A-like -11.88 -8.70 -8.16 XM_548762 cOR52X3 cOR52X3 olfactory receptor family 52 subfamily X-like -18.01 -10.23 -18.61 XM_548655 cOR9R4 cOR9R4 olfactory receptor family 9 subfamily R-like -5.25 -4.14 -5.26 XM_545130 CSTA cystatinA(stefin A) -2.76 -3.49 -4.84 XM_005637679 CYP17A1 cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1 -10.16 -10.22 -2.71 NM_001048017 CYP4A38 cytochrome P450 4A38 -6.87 -6.17 -7.05 XM_005631265 DDB2 damage-specific DNA binding protein 2, 48kDa -3.01 -11.39 -12.84 XM_846218 DSCC1 DNA replication and sister chromatid cohesion 1 -5.90 -6.14 -13.59 XM_005619243 EBF1 early B-cell factor 1 -3.31 -10.33 -22.78 XM_531834 EFEMP1 EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 -19.61 -20.52 -20.44 XM_005629925 F11 coagulation factor XI -4.02 -4.57 -4.35 NM_001003168 GH1 growth hormone -2.90 -23.46 -101.19 XM_543807 GPRC5A G protein-coupled receptor, family C, group 5, member A -13.66 -4.99 -9.59 XM_534194 GRTP1 growth hormone regulated TBC protein 1 -2.97 -3.07 -11.64 XM_845818 GTPBP6 GTP binding protein 6 (putative) -4.55 -3.95 -11.00 XM_535568 JAM2 junctional adhesion molecule 2 -2.82 -4.16 -6.54 NM_001003253 MAL mal, T-cell differentiation protein -2.02 -6.83 -3.97 XM_005639795 MAP3K13 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13 -6.13 -7.96 -11.28 XM_531830 MTIF2 mitochondrial translational initiation factor 2 -13.66 -13.75 -13.49 XM_005619491 NCAM1 neural cell adhesion molecule 1 -26.55 -17.15 -20.50 XM_541708 PDCD2L programmed cell death 2-like -2.03 -2.92 -3.69 NM_001205212 RCC1 regulator of chromosome condensation 1 -2.19 -4.20 -2.08 XM_005625365 SCAI suppressor of cancer cell invasion -2.24 -3.91 -4.40 XM_546130 SIRT1 sirtuin 1 -2.50 -2.31 -4.78 XM_005636301 SIRT4 sirtuin 4 -2.38 -2.14 -3.01 XM_005639585 SLC12A8 solute carrier family 12, member 8 -4.39 -8.08 -8.07 NM_001031636 SMCP sperm mitochondria-associated cysteine-rich protein -5.90 -5.99 -5.90 XM_005628532 TAC1 tachykinin, precursor 1 -22.32 -22.01 -22.23 XM_848996 TEX12 testis expressed 12 -2.71 -5.89 -7.22 XM_544697 TEX9 testis expressed 9 -2.29 -3.43 -8.33 XM_844681 TP53BP1 tumor protein p53 binding protein 1 -4.61 -9.21 -9.18 XM_535733 TRAT1 T cell receptor associated transmembrane adaptor 1 -2.04 -3.49 -8.80 注:a各组均与空白对照组相比；负号(-)表示下调

表 3 3个剂量组照后共同表达下调基因 Table 3 The common down-regulation genes of three radiation groups

3.共同差异表达基因的GO分析结果：结果列于表 4。根据GO富集分析对基因的注释，对0.5、2.0和5.0 Gy组的共同差异表达基因采用生物学过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)3类方法进行分析。生物学过程分析表明，3个剂量组共同差异表达基因主要涉及细胞黏连、凝血、氧化还原、免疫应答、蛋白酶解、G蛋白偶联蛋白信号通路、细胞表面受体关联信号转导和多细胞生物生殖等生物过程。而细胞组分分析表明，差异表达基因主要涉及细胞膜、高尔基体、固有膜、细胞外基质、细胞外区域、内质网和原生质膜等。另对差异基因的分子功能分析表明，其主要包括肽链内切酶活性、丝氨酸肽酶活性、RNA结合、阳离子结合、核苷酸结合和ATP结合等。

表 4(Table 4)

表 4 差异表达基因的GO分析结果 Table 4 The GO analysis of differential expressed genes 类别 编号 名称 P值 生物过程 G0:0007155 cell adhesion 0.028 8 G0:0050817 coagulation 0.023 5 G0:0051240 positive regulation of multicellular organismal process 0.0416 G0:0006508 proteolysis 0.021 9 G0:0048609 reproductive process in a multicellular organism 0.037 7 G0:0055114 oxidation reduction 0.021 9 G0:0006955 immune response 0.036 0 G0:0007186 G-protein coupled receptor protein signaling pathway 0.042 2 G0:0007166 cell surface receptor linked signal transduction 0.044 3 细胞组分 G0:0016021 integral to membrane 0.013 0 G0:0044431 Golgi apparatus part 0.043 7 G0:0031224 intrinsic to membrane 0.029 1 G0:0031012 extracellular matrix 0.026 4 G0:0005576 extracellular region 0.046 1 G0:0044421 extracellular region part 0.026 3 G0:0005783 endoplasmic reticulum 0.021 8 G0:0005886 plasma membrane 0.044 9 分子功能 G0:0004175 endopeptidase activity 0.001 7 G0:0008236 serine-type peptidase activity 0.002 6 G0:0003723 RNA binding 0.029 9 G0:0046914 transition metal ion binding 0.037 0 G0:0030554 adenyl nucleotide binding 0.044 1 G0:0001883 purine nucleoside binding 0.047 5 G0:0001882 nucleoside binding 0.047 5 G0:0043169 cation binding 0.052 5 G0:0000166 nucleotide binding 0.033 1 G0:0005524 ATP binding 0.036 7 G0:0032553 ribonucleotide binding 0.043 7 注：GO.基因本体

表 4 差异表达基因的GO分析结果 Table 4 The GO analysis of differential expressed genes

4.共同差异表达基因的KEGG分析：结果列于表 5。将3个剂量组的共同差异表达基因进行KEGG通路分析，结果表明，共涉及的通路主要包括细胞黏附分子、补体和凝血连锁作用、B细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路、Wnt信号通路、酪氨酸代谢、肿瘤途径、MAPK信号通路、吞噬作用、嗅觉转导、p53信号通路、GnRH信号通路、钙信号通路等。

表 5(Table 5)

表 5 差异表达基因的KEGG分析结果 Table 5 The KEGG analysis of differential expressed genes 编号 名称 P值 cfa05200 Pathways in cancer 0.025 0 cfa04514 Cell adhesion molecules (CAMs) 0.017 5 cfa04740 0lfactory transduction 0.019 7 cfa04310 Wnt signaling pathway 0.049 0 cfa04020 Calcium signaling pathway 0.032 1 cfa04510 Focal adhesion 0.036 5 cfa04610 Complement and coagulation cascades 0.040 0 cfa03320 PPAR signaling pathway 0.035 0 cfa04662 B cell receptor signaling pathway 0.035 9 cfa04666 Fc gamma R-mediated phagocytosis 0.029 0 cfa00010 Glycolysis / Gluconeogenesis 0.034 6 cfa04630 Jak-STAT signaling pathway 0.036 0 cfa04010 MAPK signaling pathway 0.023 1 cfa00350 Tyrosine metabolism 0.024 7 cfa00310 Lysine degradation 0.029 6 cfa05221 Acute myeloid leukemia 0.037 0 cfa04115 p53 signaling pathway 0.040 2 cfa00230 Purine metabolism 0.022 4 cfa04062 Chemokine signaling pathway 0.023 3 cfa04144 Endocytosis 0.023 7 注：KEGG.京都基因与基因组百科数据库。以上结果从其通路分析数据库获得

表 5 差异表达基因的KEGG分析结果 Table 5 The KEGG analysis of differential expressed genes

5. qRT-PCR对基因芯片数据的验证：结果列于表 6，采用qRT-PCR对差异表达的2个基因进行验证，MAP3K13基因在0.5、2.0和5.0 Gy 3个剂量组中的表达量与对照组的定量比值相比均 < 1，为下调表达；AEN基因在0.5、2.0和5.0 Gy 3个剂量组中的表达量与对照组的定量比值相比均>1，为上调表达；基因芯片结果亦表明，与对照组相比，MAP3K13基因下调表达，AEN基因上调表达，qRT-PCR定量比值结果与基因芯片结果变化相一致。

表 6(Table 6)

表 6 qRT-PCR验证的基因MAP3K13和AEN的相对表达量 Table 6 Relative expression levels of MAP3K13 and AEN genes confirmed by qRT-PCR 剂量(Gy)a MAP3K13 AEN 定量比值 芯片结果 定量比值 芯片结果 0.5 0.207 -5.13 5.690 5.32 2.0 0.134 -7.95 7.477 8.56 5.0 0.127 -11.28 5.690 8.70 注：a各组均与对照组相比; 负号(-)表示下调；AEN.凋亡增强核酸酶；MAP3K13.促分裂原活化蛋白激酶13

表 6 qRT-PCR验证的基因MAP3K13和AEN的相对表达量 Table 6 Relative expression levels of MAP3K13 and AEN genes confirmed by qRT-PCR

细胞对病理性或基因毒性包括电离辐射的复杂分子反应多是通过基因表达的改变来调节实现^[1]。电离辐射对基因表达的显著影响促使许多研究将MADH7、p53和GADD45A等敏感表达基因拟定为辐射损伤的生物标志物^[2-3]。除目前尚有争论的低剂量兴奋效应外，随照射剂量的增大，辐射损伤效应越严重，体现在造血、血液系统、免疫系统、消化系统、生殖系统及皮肤等生物体各系统部位不同程度的病理变化。本研究对比格犬进行0.5、2.0和5.0 Gy 3个剂量急性照射，照后6 h，与空白对照组相比，3组外周血淋巴细胞差异表达基因的数目随剂量的增大而增加，表明剂量越大，电离辐射对淋巴细胞的损伤越大，射线的高能量造成细胞结构破坏和代谢失调，与多个细胞各生物学过程相关基因的表达异常凸现出来。

利用基因芯片技术对不同剂量照射后比格犬外周血淋巴细胞的基因进行筛选，0.5、2.0和5.0 Gy 3个剂量的共同上调表达2倍以上的基因呈现随剂量的增大而增加趋势。其中，显著上调基因ICAM1即细胞间黏附分子，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族，致炎因子、细胞应激、感染等主要通过ICAM1基因的转录增加ICAM1的表达^[6]。有关ICAM1在放射性损伤中的研究表明，以16 Gy ⁶⁰Co γ射线照射建立的小鼠放射性肺损伤模型，肺组织中的ICAM1蛋白存在异常表达，其以基因芯片分析ICAM1基因沉默后全基因组表达谱的变化，发现ICAM1可能通过Bax/Bcl-2、FasL/Fas、MAPK等通路参与细胞增殖、凋亡等生理过程^[7]。另外，上调表达基因C3，它是机体补体系统两条激活途径的汇合点，在补体活化过程中起着枢纽作用，并为替代途径激活的关键分子，一直被认为是外周血和组织液循环中的促炎症反应蛋白的组成，是自然免疫和获得性免疫中重要的介质^[4]。本研究中，5.0 Gy组C3的上调达到16.87倍，表明补体系统在电离辐射条件下被激活以补偿免疫系统的损伤。在Romaica等^[4]的研究中，对放疗前后的患者的血样进行研究，其中C3亦表现为上调。另外上调表达基因LOC475113为淋巴细胞抗原类6B，与机体免疫应答相关。本研究中低剂量0.5 Gy组上调2.33倍，随剂量增大，上调倍数增加，5.0 Gy组上调至20.72倍。TNK2又称ACK1，在本研究中为表达上调，ACK1可在多种细胞类型中表达，参与肿瘤发生、细胞存活和迁移，在许多肿瘤细胞例如肺癌和前列腺癌中ACK1表现为基因扩增和过表达^[8]。基因AEN参与细胞凋亡过程，在结果中0.5、2.0及5.0 Gy剂量组中均为上调表达，这与Ghandhi等^[9]的相关研究一致，其将健康志愿者的外周血分别进行X射线低剂量率照射和急性照射，基因芯片和qRT-PCR分析的结果均表明AEN基因为上调。

急性照射不仅引起部分基因的上调表达，亦引起许多基因表达的显著下调。研究表明，辐射的主要效应表现在参与多种生物过程包括细胞周期调节和转录相关基因的下调^[10]。本研究中CCAR1和CCNE1均下调2倍以上。生长激素相关基因GH和GRTP1下调亦很明显，剂量越大，下调倍数越大。实际上生长激素和它的受体通过形成旁分泌回路刺激细胞增殖，但在本研究结果中显示为下调。差异表达下调的基因还包括RSPO2、SIRT1、SIRT4、SCAI、CSTA、CDO1和TP53BP1等，结果显示均差异表达2倍以上，研究表明，这些基因均与肿瘤抑制相关，比如SIRT1可通过对不同的组蛋白和非组蛋白(包括H1、H3、H4、p53、p73和FOXOs等)的去乙酰化实现对多种抑癌因子的下调^[11]。Minatani等^[12]研究表明，CDO1基因在乳腺癌、肺癌、膀胱癌和肠癌等中频繁甲基化，起到肿瘤抑制的作用。此外，犬的嗅觉较为敏感发达，辐射损伤可能导致嗅觉功能的下降，在本研究中5个嗅觉受体家族基因均下调2倍以上。

GO富集分析结果表明，差异表达基因主要与细胞连接、免疫应答、信号转导、氧化还原及物质代谢等重要的生物学过程相关，在Ghandhi等^[9]的研究中，也显示低剂量率或急性照射均能使细胞连接、细胞内生物过程、免疫过程和B细胞介导的免疫应答这些生物学功能受到影响。细胞组分不仅涉及细胞内细胞器也与细胞膜及细胞外区域密切相关，一旦暴露于电离辐射，会导致细胞内激酶和生长因子的释放，从而引起细胞间或组织间在内的微环境的改变^[13]，这些因子的释放通过信号转导而扩大电离辐射引起的损伤效应，使相邻细胞相应地改变其生理功能。

细胞外刺激可通过多条信号通路传导至细胞内，调控相关基因，引导细胞对刺激产生应答和适应。KEGG分析即将0.5、2.0和5.0 Gy 3个剂量水平下机体共同差异表达的基因进行分类和统计，涉及的通路也集中在免疫应答、信号转导、肿瘤相关途径和代谢通路等。其中与电离辐射造成的免疫系统损伤相对应，3个不同剂量的共同差异表达基因均涉及免疫应答方面的吞噬作用、B细胞受体信号通路等生物通路。电离辐射的致癌效应为不确定性效应^[1]，但在急性照射后6 h，生物体内肿瘤相关基因均异常表达，KEGG分析表明包括肿瘤途径、p53信号通路和Wnt信号通路等均有涉及，尤其是p53通路，研究表明在外周血暴露于低剂量至高剂量(0.56~4.45 Gy)，p53通路均被显著影响^[8]。另外结果显示细胞黏附分子的表达差异及通路分析均显著，细胞黏附是细胞维持形态结构与功能的生物现象，研究表明黏附分子的改变不仅可以改变淋巴细胞亲和力，而且也容易受到细胞因子、炎症介质对其表达调节，这也是辐射损伤引起多种效应相互作用的反映^[14]。另外JAK-STAT信号通路与细胞生长、增殖、分化以及造血过程关系密切，MAPK信号通路也是生物体内重要的信号转导系统之一，均参与介导细胞生长、发育、分化、死亡及细胞间的功能同步等多种细胞过程，研究表明活性氧系统中的H₂O₂能引起MAPK和STAT3的磷酰化，诱导SP-A和SP-B (活性氧可诱导产生的基因)的表达，降低TTF-1 DNA结合活力^[15-16]，相关研究亦表明MAPK通路一直为辐射损伤研究中标志性的重要生物学通路^[17-18]。此外，对辐射损伤下差异基因的通路分析和研究中，Kamal等^[19]发现2 Gy照射雌性C57BL/6J小鼠，其乳腺组织在照后2个月后其差异表达基因在37个重要通路表现显著，多数涉及参与细胞生长、分化、增殖、乳腺癌、代谢、氧化磷酸化和糖原异生等生理化学过程。本研究结果与此一致。且本课题组前期研究表明，2 Gy γ射线全身照射大鼠外周血淋巴细胞12 h，差异表达基因涉及到过氧化物酶体、黏着连接和B细胞受体信号途径等通路，以及对大鼠离体外周血淋巴细胞进行2.0 Gy γ射线照射，表明照后不同时间辐射引起的损伤可能不同，涉及的差异基因和通路亦存在差异^[20-21]。

结合早期的辐射损伤效应研究结果，利用基因芯片技术对不同剂量急性照射下犬外周血淋巴细胞基因表达谱的变化及生物学过程和通路进行了研究探讨。电离辐射损伤与射线种类、照射剂量及剂量率、物种敏感性差异等均相关，甚至体内和体外照射研究结果亦可能存在偏差，并且分子机制研究涉及基因数目庞大、作用机制复杂，无论在基因标志物筛选以及探讨辐射损伤机制以期用于靶向基因治疗，均需做进一步的深入研究。