2017, Vol. 37
2. 830011 乌鲁木齐, 新疆医科大学第一附属医院泌尿中心
2. Department of Urology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
高达70%肝癌(HCC)患者确诊时已是晚期，丧失手术机会，预后极差，中位生存时间＜1年[1-2]。2016年我国《原发性肝癌放疗共识》推荐放射治疗是不可手术肝癌的一种治疗方式[3]，但疗效并不理想，因此，如何增加肝癌细胞的放射敏感性，对提高肝癌放疗疗效具有重要意义。
在传统中药中，薏苡仁具有抗肿瘤作用[4]。体外实验已证实，薏苡仁对多种恶性肿瘤细胞的生长具有抑制作用，同时可以促进细胞凋亡[5]。临床研究显示，薏苡仁可单独用于患者的抗肿瘤治疗，或与化疗、放疗、靶向药物联合治疗均有抗肿瘤作用，并能改善肿瘤患者的生活质量。它在肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等的研究中显示出较好的应用前景[6-10]，但薏苡仁对肝癌是否具有放射增敏的作用尚不明确。本研究以人肝癌细胞Bel-7402为研究对象，应用薏苡仁注射液联合X射线处理Bel-7402细胞，研究薏苡仁对放射敏感性的影响，为提高肝癌放疗疗效奠定实验基础和提供理论依据。
材料与方法1.材料：肝癌细胞系Bel-7402购自武汉巴菲尔公司。胎牛血清购自美国GIBCO公司，青链霉素混合液(100X)、DMEM高糖培养基、胰酶均购自美国Hyclone公司, 四甲基偶氮唑盐比色(MTT)实验所用试剂购自南京建成公司，碘化丙啶(PI)购自美国BD公司。薏苡仁注射液为浙江康莱特药业公司生产(生产批号1503163-1)，Bax、Bcl-2及β-肌动蛋白(鼠抗人)抗体均购于美国CST公司。
2.细胞培养及分组：人肝癌细胞Bel-7402用含10%灭活胎牛血清和1%青链霉素混合液的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养，细胞贴壁生长，以0.25%的胰酶消化，2~3 d传代1次，取对数生长期细胞继续进行实验。将所测定的细胞分为空白对照组、薏苡仁组(4和12 μmol/L)、单纯照射组(8 Gy)及联合处理组(12 μmol/L+8 Gy)。
3.照射条件：美国Varian 2300C/D直线加速器6 MV X射线照射，源靶距100 cm，照射野10 cm×10 cm。培养皿面上覆盖1 cm厚铅板于室温下照射，吸收剂量8 Gy, 吸收剂量率300 cGy/min。药物处理后24 h，再进行照射。
4. MTT法测细胞存活率：用0.25%的胰酶消化对数生长期的细胞，制备单细胞悬液。将肝癌细胞Bel-7402以4×104/ml的密度接种到96孔培养板，每孔含培养液100 μl，在37℃含5%CO2饱和湿度条件下培养24 h后，更换培养液，分别加入含浓度为4、8、12、16、20、24和32 μmol/L的薏苡仁注射液的细胞培养液200 μl，每一浓度设6个复孔，加药后的细胞继续培养48 h后，于实验终止前4 h每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl, 继续培养4 h，然后吸去上清，加入200 μl的二甲基亚砜(DMSO)，室温条件下振荡混匀后，酶联免疫检测分析仪测定495 mm处吸光度(A)值，表示细胞存活率。
5.流式细胞技术检测细胞凋亡：取对数生长期的肝癌细胞Bel-7402按4×104/ml密度接种于6孔板上，分别加入含4和12 μmol/L的薏苡仁注射液的培养液，作用48 h，消化细胞后，离心半径8 cm，2 500 r/min, 离心5 min收集细胞，使用PBS洗1次，用0.5 ml PBS重悬细胞，加入300 Annexin V结合液重悬细胞，加入5 μl Annexin V异硫氢酸荧光素(FITC)和5 μl的PI轻摇混匀，室温避光孵育15 min，即用流式细胞仪定量检测，同时以不加Annexin V和加入Annexin V及PI的各1管作为阴性对照。每组实验重复3次。
6. Real-time PCR实验：将对数期细胞接种于6孔培养板中(1×105/孔)，贴壁24 h按照实验分组进行处理48 h后，加入1 ml TRIzol溶液按照操作说明提取总RNA并测定RNA浓度。以1 μg RNA为模板, 按照RT-PCR反转录试剂盒操作说明，经基因组DNA的去除反应和反转录反应合成cDNA；以1 μl cDNA为模板，进行Real-time PCR反应。反应体系为10 μl，包括SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ (2×) 5.0 μl、引物0.5 μl、cDNA 1.0 μl、ddH2O 3.0 μl；反应条件为：95℃10 s，95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，45个循环。Bax引物：上游为5′ GAGGAAGTCCAGTGTCCAGC 3′；下游为5′ CTGCAGAGGATGATTGCTGA 3′；Bcl-2引物：上游为5′ CGACTTGCAGAGATGTC 3′；下游为5′ CATCCACAGAGCGATGTTGT 3′；β-肌动蛋白引物：上游为5′ GCACCACACTTTCTACACAATGA 3′；下游为5′ GAACCGCTCATTGCCGATAGT 3′。
7. Western blot实验：检测Bax、Bcl-2蛋白表达，将对数期细胞接种于6孔培养板中(1×105/孔)，贴壁24 h后按照各实验分组进行处理48 h后，提取总蛋白并定量。对各处理组提取总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，40℃孵育一抗过夜，TBST缓冲液清洗后室温孵育二抗1 h，再次洗膜后加入荧光发光液检测。
8.细胞克隆形成实验：将对数生长期的细胞按照不同照射剂量接种不同细胞数至6孔板上，分为单纯照射组和联合处理组。联合处理组给予含12 μmol/L的薏苡仁注射液的培养液作用24 h后与单纯照射组一起分别接受0、2、4、6、8和10 Gy的6 MV的X射线照射，继续培养2周，用无水甲醇固定15 min，结晶紫染色1 h后，洗净后室温晾干，最后观察和记录含有≥50个细胞的克隆个数，克隆形成率(PE)=照组克隆数/实验组细胞数×100%，存活分数(SF)=克隆数/(实验组细胞数×PE)。按单击多靶模型SF=1-(1-eD/D0)N拟合细胞存活曲线，计算反映细胞敏感性的参数D0、Dq值。基于计算出的单纯照射组和联合处理组D0值，计算放射增敏比(SER)，所有实验均重复3次以上。
9.统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行分析，实验结果方差齐，多组间比较采用方差分析，符合正态分布的数据用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，克隆形成实验中细胞存活曲线及回归方程采用Graph Prism 6.0软件进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1.薏苡仁注射液及联合X射线对Bel-7402细胞生长的抑制作用：4、8、12、16、20、24和32 μmol/L的薏苡仁注射液处理Bel-7402细胞48 h后，各浓度的细胞抑制率分别为(14.43±2.12)%、(23.64±1.47)%、(28.73±2.36)%、(32.38±2.79)%、(37.68±1.49)%、(41.99±0.78)%和(43.43±3.21)%(F=118.58，P＜0.01)，提示薏苡仁注射液对Bel-7402细胞生长有明显的抑制作用，并具有浓度依赖性。
空白对照组、薏苡仁注射液组(4和12 μmol/L)、单纯照射组(8 Gy)及联合处理组(12 μmol/L+8 Gy)处理后48 h，联合处理组的细胞抑制率明显高于薏苡仁组(12 μmol/L)、单纯照射组(8 Gy) (t=17.03、11.26，P＜0.05)。提示薏苡仁与X射线联合可以提高对肝癌细胞生长的抑制作用(图 1)。
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图 1 各处理组照射后不同时间对肝癌细胞生长的抑制率 注：a与空白对照组比较，t=-2.14~76.85，P＜0.05；b与薏苡仁4 μmol/L组比较，t=-1.58~36.77，P＜0.05；c与薏苡仁12 μmol/L组比较，t=17.03，P＜0.05；d与单纯照射组比较，t=11.26，P＜0.05 Figure 1 The inhibition rate of hepatoma cells in each treatment group at different time after irradiation |
2.薏苡仁注射液对人肝癌细胞Bel-7402凋亡的影响：空白对照组、薏苡仁组(4和12 μmol/L)、单纯照射组、联合处理组细胞凋亡率分别为2.45%、8.36%、14.31%、16.32%、34.21%。与薏苡仁组和单纯照射组相比，联合处理组的凋亡率明显增加(t=24.80、20.19, P＜0.05)，薏苡仁注射液与X射线两者联合能明显诱导肝癌细胞凋亡，二者具有协同作用。
3.薏苡仁联合X射线对肝癌细胞Bax和Bcl-2 mRNA、蛋白表达水平的影响：RT-PCR结果显示，处理48 h后，与空白对照组相比，薏苡仁组、单纯照射组及联合处理组Bax的mRNA表达水平依次升高(F=437.92, P＜0.05)，其中联合处理组Bax的mRNA表达最高, 高于薏苡仁组与单纯照射组(t=3.47、5.25, P＜0.05)，见表 1。同时，Western blot显示Bax蛋白表达与mRNA水平基本一致，亦呈逐渐升高趋势(F=67.91，P＜0.05)。薏苡仁组、单纯照射组及联合处理组Bcl-2的mRNA表达水平逐渐降低，呈逐渐下降趋势(F=31.18, P＜0.05)，但联合处理组Bcl-2的mRNA水平与薏苡仁组、单纯照射组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。Western blot结果显示，与薏苡仁组、单纯照射组相比，联合处理组Bcl-2蛋白表达水平最低(t=14.42、8.35，P＜0.05，图 2)。
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表 1 各处理组肝癌细胞Bax、Bcl-2 mRNA的相对表达(x±s) Table 1 The relative expression of mRNA in each group(x±s) |
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图 2 各处理组肝癌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达电泳图 注：1.空白对照组；2.薏苡仁组；3.单纯照射组；4.联合处理组 Figure 2 The protein levels electrophorograms of Bax, Bcl-2 of hepatoma cells in different treatment groups |
4.薏苡仁注射液对人肝癌Bel-7402细胞的放射敏感性的影响：细胞克隆形成法观察到，在单纯照射组中，随着X射线剂量逐渐增加(0、2、4、6、8、10和10 Gy)，肝癌细胞存活数逐渐下降。在联合处理组中，加入薏苡仁注射液12 μmol/L培养2周后，细胞存活数随着照射剂量的逐步增加，细胞存活数进一步降低，提示X射线照射剂量与细胞存活数存在反向伴随关系，并且薏苡仁与X射线联合可以增强射线对肝癌细胞的杀灭作用。采用单击多靶模型拟合剂量存活曲线(图 3)。单纯照射组和联合处理组D0值分别是4.27和3.34 Gy，放射增敏比SERD0为1.27，提示薏苡仁注射液能提高肝癌Bel-7402细胞对X射线的放射敏感性。
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图 3 单击多靶模型拟合剂量存活曲线 Figure 3 Survival curved by single-hit multitarget model |
讨论
薏苡仁注射液是中药薏苡仁中提炼的薏苡仁油为主要成分，是禾本科植物薏苡的成熟种仁，具有解热、镇静、镇痛作用[10]。近年来研究表明，薏苡仁可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用[11]。但薏苡仁在肝癌细胞中是否能协同射线杀伤肿瘤，具有放射增敏的作用，目前尚无报道。本研究首次报道薏苡仁对X射线照射肝癌细胞具有放射增敏作用，为肝癌放疗的新思路提供理论依据。本研究发现，单纯薏苡仁可以抑制肝癌细胞Bel-7402的生长，随药物浓度增加，抑制率相应增加，呈剂量依赖趋势。当薏苡仁联合X射线照射时，其抑制率进一步下降，表明薏苡仁可以增加X射线对肿瘤细胞的杀灭作用，并且具有协同作用。保学明等[8]报道在结肠癌中薏苡仁也能抑制肿瘤生长，其原因是薏苡仁可以影响细胞周期，减少肿瘤细胞进入G0、G1期细胞比例，导致S期细胞百分比下降，从而减少细胞分裂，抑制细胞增殖活性。
此外，本研究观察薏苡仁对肝癌Bel-7402细胞凋亡的影响，4和12 μmol/L薏苡仁与Bel-7402细胞分别作用48 h后，薏苡仁组的凋亡率高于空白对照组，高浓度组的凋亡率高于低浓度组，提示薏苡仁对肝癌细胞具有诱导凋亡的作用，并且浓度高的促凋亡能力更强。通过薏苡仁联合X射线处理Bel-7402细胞，发现联合处理组的凋亡率最高，提示薏苡仁能增强X射线对肝癌细胞诱导凋亡的作用。
目前有学者认为，细胞凋亡的分子生物学机制与以下有关，端粒酶活化，Caspase蛋白的过表达，凋亡相关信号通路的激活，周期蛋白Cyclin D和P27的表达上调，以及Bax和Bcl-2蛋白的过表达[12]。其中Bcl-2家族与细胞凋亡关系最为密切，它包括Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bad等。Bcl-2是重要的抑制细胞凋亡的基因，而其同源基因Bax则诱导凋亡[13]。那么薏苡仁协同X射线促进凋亡与Bcl-2家族是否有关，值得探讨。为此，本研究检测Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达，发现薏苡仁可上调肝癌细胞Bax的mRNA表达，下调Bcl-2的mRNA表达。同时联合处理组Bax表达最高，Bcl-2表达最低，与凋亡率结果一致。提示薏苡仁可能通过调节Bax和Bcl-2发挥诱导凋亡的作用，并且可以协同X射线对肝癌细胞的凋亡作用。
本研究通过克隆形成实验发现，联合处理组细胞克隆形成率低于单纯照射组，经过单击多靶模型拟合，联合处理组的放射增敏比为1.37，说明薏苡仁对X射线照射肝癌细胞具有放射增敏作用。这与吕品田等[14]应用薏苡仁联合X射线在肺癌中的研究报道一致。其原因可能是薏苡通过调节细胞周期，阻滞细胞至G2期和M期，使更多肿瘤细胞进入对放射敏感的G2+M期，增强X射线杀伤肿瘤细胞的能力，提高凋亡率，因此薏苡仁具有放射增敏作用。
综上，薏苡仁可以抑制肝癌细胞的生长，诱导凋亡，协同X射线照射杀灭肿瘤细胞，具有放射增敏的作用，可能是通过调节凋亡相关因子Bax和Bcl-2发挥作用，但其深入的分子机制还有待进一步探讨和验证。
利益冲突 本文研究者及家属，未因进行该研究而接受任何不正当的职务或经费利益，在此对研究的独立性和科学性予以保证作者贡献声明 杨颖负责实验操作；李志鹏撰写论文；贾春丽修改论文；刘强、杨志芳负责细胞照射；张瑞丽、毛睿负责数据统计分析；张华、艾斯克尔·吐拉洪指导实验；包永星设计研究方案，分析讨论研究结果
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