CT是目前临床最常用的影像检查设备，应用日趋广泛，由此带来的医疗电离辐射问题一直受到业内关注。目前，单次CT检查辐射剂量已大幅度降低^[1]，但总医源性辐射剂量仍居高不下^[2-3]。碘对比剂是CT检查中定性诊断不可缺少的阳性对比剂，广泛应用于临床。近年有研究认为，碘对比剂可增强X射线对人体辐射的生物学效应^[3]，尽管这一观点仍存在一定争议^[4]，但同其肾不良反应和过敏反应缺陷一样，正确认识碘对比剂对人体的健康影响，并研究应对方法，有利于其合理应用。本研究使用免疫荧光法，以CT泌尿道造影(computed tomography urography，CTU)患者为研究对象，评估对照组和试验组患者单次CT扫描前后，其外周血淋巴细胞内γ-H2AX量的变化，旨在评估碘对比剂对CT辐射致DNA损伤的影响。

1.患者选择：本研究经过宁波大学医学院附属鄞州医院伦理委员会同意，所有患者检查前均签署知情同意书。选取宁波大学医学院附属鄞州医院2016年1月—2016年8月临床怀疑为泌尿系疾病准备行CTU检查的患者，按照随机数表法分为对照组和试验组。准入标准：年龄18~70岁；临床初诊为泌尿道疾病并符合CTU检查适应证；无白血病、淋巴瘤等恶性疾病；3个月内未接受任何X射线检查或治疗。排除标准：高龄或未成年患者(＜18岁或＞70岁)；碘对比剂过敏；严重肾功能衰竭，肾脏术后。共60例患者入组检查。两组患者基本资料见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 两组患者外周静脉血淋巴细胞平均焦点数(x±s) Table 1 The average focus of peripheral blood lymphocytes in both groups of patients(x±s) 组别 例数 CTDIvol(mGy) DLP(mGy·cm) E(mSv) 扫描前平均焦点数 扫描后平均焦点数 差值 对照组 24 6.83±6.55 284.39±110.55 4.83±1.88 0.06±0.02 1.06±0.27 0.97±0.23 试验组 26 6.55±3.21 267.90±97.70 4.55±1.66 0.06±0.03 1.42±0.50 1.34±0.41 t值 0.30 0.56 0.56 0.64 -3.09 -3.25 P值 0.76 0.58 0.58 0.50 0.00 0.00   注：γ-H2AX焦点计数单位为个/细胞；CTDIvol.CT容积剂量指数；DLP.剂量长度乘积；E.有效剂量。E=DLP×k，成人腹部k=0.015 mSv·mGy-1·cm-1

表 1 两组患者外周静脉血淋巴细胞平均焦点数(x±s) Table 1 The average focus of peripheral blood lymphocytes in both groups of patients(x±s)

2.扫描、注射及血样采集方案：扫描前10 h禁食，扫描前15 min饮水1 000 ml。扫描范围：自双肾上极至耻骨联合水平。扫描机器：64排螺旋CT(Brilliance 64，荷兰飞利浦公司)层厚0.65 mm，间距0.65 mm，最大旋转速300 ms/圈。对照组采用常规法CTU检查(平扫、皮质期、髓质期和排泄期)，试验组采用分次注射法CTU检查(平扫、皮髓质-排泄期)。两组患者扫描均分为2次进行：对照组，先行腹部CT平扫，扫描前10 min内抽取肘静脉血2 ml，扫描后10 min内再次抽取肘静脉血，3 d后补充增强扫描；试验组，对比剂注射前10 min内抽取肘静脉血2 ml，后行分次注射法CTU增强扫描(具体注射方案为：先以3 ml/s速率注入40 ml对比剂，注射结束后患者静躺于检查床等待，850 s后以同样速率再次注射50 ml对比剂，30 s后启动实质-排泄期扫描)，扫描结束后10 min内再次抽取肘静脉血2 ml，3 d后补充平扫。对比剂使用碘海醇350 mg I/ml (上海通用电器药业公司)，双筒高压注射器注射及抽血点为经肘正中静脉。

3.辐射剂量计算：有效剂量E的计算以各样本检查后的剂量长度乘积(DLP)值为基础，乘以腹部系数k值(成人腹部k值为0.015 mSv·mGy^-1·cm^-1)。

4.淋巴细胞处理及γ-H2AX焦点免疫荧光检测：外周静脉血暂存于肝素抗凝管(2 ml/管)，加入1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，混匀后毛细吸管缓慢移至已放有3 ml淋巴细胞Ficoll分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，200 ml，LTS-1077)的试管中，常规情况下血样自动浮于Ficoll液上层。离心20 min，离心半径25.53 cm，1 500 r/min，分离淋巴细胞。毛细吸管提取悬浮于中层的淋巴细胞，PBS离心洗涤3次，离心半径25.53 cm，1 500 r/min离心5 min，加入4%多聚甲醛1 ml固定(4℃，15 min)。洗涤1次，加入0.2%Triton-X 100(美国EMD Millipore公司)500 μl破膜30 min。然后使用200 μl山羊血清(北京索莱宝科技有限公司)避光封闭1 h。洗涤后取20 μl细胞悬液滴于防滑脱玻片，风干后依次使用0.1%NP40液(南京奥多福尼生物科技有限公司)和PBS液洗涤3次，10 min后乙醇梯度脱水(浓度依次为70%、85%和100%)，后加入10 μl一抗(鼠抗人γ-H2AX抗体，1：150，美国EMD Millipore公司)(4℃，孵育10 h)，洗涤同前，加入20 μl二抗(FITC山羊抗鼠IgG抗体，1：250，美国EMD Millipore公司)常温孵育45 min，洗涤同前，使用10 μl含甘油DAPI(上海翊圣生物科技有限公司)复染、封片。于正置荧光显微镜×30倍下观察，取5个视野/玻片，计数至少50细胞/视野，以焦点/细胞数×100%计算并取平均值。以上处理流程由2名2年以上实验室工作经历的技术人员处理，除特殊注明外，均在室温下进行。

5.统计学处理：采用SPSS 21.0软件进行数据分析。计量资料用x±s表示。两组扫描前后的辐射剂量和γ-H2AX焦点数差异比较使用两独立样本t检验或校正t检验(非正态分布时)。P＜0.05为差异有统计学意义。

表 2(Table 2)

表 2 两组患者扫描前后γ-H2AX在性别和年龄上的差异(x±s) Table 2 Differences in gender and age of γ-H2AX before and after scanning in both groups(x±s) 组别 例数 扫描前 扫描后 γ-H2AX焦点差值 对照组   男 10 0.06±0.03 1.00±0.21 0.94±0.18   女 14 0.06±0.03 1.11±0.31 1.04±0.29   ≤50岁 12 0.04±0.02 0.84±0.18 0.80±0.18   ＞50岁 12 0.09±0.02 1.25±0.18 1.16±0.18a 试验组   男 12 0.05±0.02 1.28±0.36 1.23±0.34   女 14 0.07±0.05 1.55±0.53 1.48±0.49   ≤50岁 11 0.03±0.01 0.97±0.21 0.94±0.21   ＞50岁 16 0.08±0.04 1.76±0.28 1.68±0.26b   注：a与对照组≤50岁γ-H2AX焦点差值比较，t=-4.76，P＜0.05；b与试验组≤50岁γ-H2AX焦点差值比较，t=-8.16，P＜0.05

表 2 两组患者扫描前后γ-H2AX在性别和年龄上的差异(x±s) Table 2 Differences in gender and age of γ-H2AX before and after scanning in both groups(x±s)

1.入组结果：共50例患者顺利完成CT扫描和免疫荧光法γ-H2AX焦点数测定，其中对照组24例，中位年龄43岁(27~68岁)，男10例，女14例，体质量指数(23.84±2.44)kg/m²；试验组26例，中位年龄44岁(25~70岁)，男12例，女14例，体质量指数(23.71±2.40)kg/m²，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.γ-H2AX焦点测定结果：对照组和试验组单次CT扫描所接受的有效剂量E分别为(4.83±1.88)和(4.55±1.66) mSv，差异无统计学意义(P＞0.05)；扫描前后外周静脉血内每个淋巴细胞γ-H2AX焦点数分别为对照组(0.06±0.02，1.06±0.27)和试验组(0.06±0.03，1.42±0.50)个/细胞，差值为(0.97±0.23)和(1.34±0.41)个/细胞，差异有统计学意义(t=-3.25，P＜0.05，表 1)，试验组焦点量较对照组明显升高(图 1)，升高幅度约为38.14%。

图 1 对照组和试验组CT扫描前后外周静脉血淋巴细胞核内γ-H2AX焦点变化 A.试验组扫描前；B.试验组扫描后C.对照组扫描前；D.对照组扫描后； 注：白色箭头为核内γ-H2AX焦点 Figure 1 Changes of γ-H2AX foci in the peripheral blood lymphocytes in two groups before and after CT scan A. Before CT scan in control group; B. Before CT scan in test group; C. After CT scan in control group; D. After CT scan in test group

两组患者扫描前后不同性别γ-H2AX焦点差异无统计学意义(P＞0.05)，受年龄影响(按50岁划分)差异有统计学意义(t=-4.76，P＜0.05)，两组γ-H2AX焦点差值差异有统计学意义(t=-8.16，P＜0.05)。

CT是目前临床应用较为广泛的影像检查设备，对疾病的早期发现和鉴别诊断起重要作用，临床医生也越来越依赖影像检查带来的便利性。但过量的X射线照射对机体有致癌和致畸作用。其中，最严重的事件是DNA双链的断裂，此为X射线致瘤和致畸的分子基础。H2AX是组蛋白的一种，DNA双链损伤后H2AX迅速磷酸化，形成γ-H2AX，用于DNA断链的修复，并且该γ-H2AX和DNA断链在数量呈现一一对应关系。因此，通过免疫荧光法测定γ-H2AX焦点变化评估CT辐射后DNA的断链数量，是目前定量评估X射线辐射导致DNA损伤较准确的方法^[5]。

碘对比剂是CT检查中定性诊断不可缺少的阳性对比剂，临床广泛应用于CT和其他X射线造影。尽管有轻微的肾毒性和偶发的过敏反应等缺陷^[6]，碘对比剂仍然是当前不可替代的CT对比剂。国外有学者认为，碘对比剂可增加X射线辐射对人体DNA损伤，即X射线的“放大效应”^{[3, 6-7]}。尽管该观点有一定争论^[4]。本研究结果显示，实验组在碘对比剂存在的情况下行CT扫描导致γ-H2AX焦点计数较对照组增高了约36.17%，与Piechowiak等^[3]的研究结果一致。不过，产生这种现象的机制仍有争论：Piechowiak等^[3]和Hill^[8]认为，高密度的碘对比剂阻挡了CT扫描时X射线对人体的衰减，导致人体组织吸收更多的X射线，而二次射线的释放又与物质密度有关，高密度碘剂比人体软组织更容易和更多得释放二次射线，两者协同作用使得二次射线作用增强，作用于人体，导致血液淋巴细胞内的DNA双链损伤增多^[9-11]。有研究发现，年龄和性别等因素对γ-H2AX焦点数量有一定影响^[5]。本研究结果显示，老年人的γ-H2AX焦点数量高于年轻人，支持该观点。也有研究发现，大部分肿瘤患者的γ-H2AX焦点数量高于健康人^[5]。因此，人体内γ-H2AX焦点数变化的干扰因素较多，对该现象机制的解释仍需大量研究。本研究中，尽管尚需排除碘对比剂对淋巴细胞的直接损伤，但因为人体可通过肾脏，不断排泄摄入的碘对比剂，这一生理功能在体外实验很难模拟，因此，未来仍需进一步模拟人体环境进行体外实验，以排除碘对比剂的直接影响。不过，本研究的结论也提示临床工作者在实践中尽量减少碘对比剂的用量，有助于减少增强CT检查对淋巴细胞DNA双链的损伤。随着迭代算法和其他低辐射CT技术的应用，低浓度碘对比剂增强扫描是近年来较为热门的话题，减少碘对比剂的用量可减少肾不良反应与过敏反应等风险，同时减轻人体DNA损伤也应成为碘对比剂成像的理论基础之一。

本研究结果对临床的意义有以下几个方面：①目前临床CT辐射剂量常使用剂量长度乘积(DLP)乘以扫描的各部位系数k值来评估，增强CT扫描的辐射剂量评估应与平扫有所区别，需另外增加碘对比剂的影响^[3]。②本研究从辐射生物学角度支持低浓度对比剂和低千伏CT成像(简称“双低”^[12]CT成像)较单独低千伏成像更有利于降低辐射损伤的生物学效应。③临床工作中，应适当减少患者增强CT随访的次数和避免体内碘对比剂未排泄完全时进行放射治疗。

当然，人体对X射线导致的DNA损伤有一定的修复能力，在疾病(尤其是肿瘤性疾病)前提下，辐射防护需要辩证思考，不应过度注重碘对比剂对辐射损伤的影响而耽误疾病的诊疗。避免因过度考虑碘对比剂的不利因素而影响疾病的诊疗^{[2, 13-14]}。

本研究的局限性有以下几点：①样本量较少，研究结果可能有一定偏倚，需要后续大样本验证。②由于实验条件限制，未能进一步评估碘对比剂对DNA断链的单独影响，后续将进行这方面的研究。③本试验的评估对象是外周静脉血淋巴细胞，增强扫描时实体组织和器官内，尤其是乏血供组织内的碘含量较少，其扫描前后的γ-H2AX焦点变化量需进一步探索。

综上所述，碘对比剂可增强CT检查的辐射生物学效应，建议临床工作中应尽可能降低CT增强检查的碘对比剂使用量。