随着军用核设施的广泛应用和核能事业的快速发展，其在保障国家安全和促进国民经济增长的同时，也带来一定的潜在风险。在各种核与辐射事故的情况下，如何对事故伤员进行快速分类诊断、及时准确预判可能发生的远后效应，是指导应急处置和临床救治的基本遵循和重要科学问题，也对辐射生物剂量学创新发展提出了新的要求和挑战。本文从细胞遗传学技术、淋巴细胞γ-H2AX分子、代谢物和miRNA等放射分子标志物，以及多分子表达谱评估受照剂量等角度对辐射生物剂量学的研究进展进行综述。

辐射生物剂量估算技术是指根据机体受到照射后的某些生物学指标变化，确定机体受到的照射剂量的技术方法，对于具体的生物剂量测量技术，则称为辐射生物剂量计。辐射生物剂量计主要用于判断外照射剂量，不作为内照射剂量判断的方法，但可作为内照射产生危害的辅助评估手段。目前，以染色体畸变为代表的细胞遗传学技术、外周血淋巴细胞计数分析、呕吐等临床指征是主要辐射生物剂量计，在国内外多起放射性事故伤员的诊治中得以验证和应用，相关技术已经列入相关国家标准，推广使用。

1.细胞遗传学技术：以染色体畸变为代表的细胞遗传学技术作为辐射生物剂量估算的金标准方法，在多起放射性事故的救治中得到广泛的应用和认可。国际原子能机构(IAEA)出版物对细胞遗传学技术进行了较为系统、全面的归纳和阐述^[1]，形成下面几个共识：从样品采集时间来看，染色体畸变分析(双着丝粒和着丝粒环，dic+r)、微核分析和早熟凝集染色体分析，在照射后4周内采样效果较好。染色体易位属于稳定性畸变，照射后终身稳定，通过荧光原位杂交分析(FISH)可对受照人员进行回顾性剂量重建。在适用的照射剂量方面，染色体畸变分析的适用剂量范围为0.1~5 Gy，双核淋巴细胞微核分析的适用剂量范围是0.3~4 Gy，早熟凝集染色体分析为0.2~20 Gy。所以说，细胞遗传学技术在检测剂量范围上可覆盖0.1~20 Gy的剂量范围，可以满足大多数事故患者的剂量估算。

细胞遗传学方法通常需要对外周血淋巴细胞体外培养48~72 h，标本的制备分析需要在专业的实验室内，由受过专业培训的技术人员完成，过程较为繁琐复杂。在应对少量(数人至十余人)事故性放射病患者的剂量估算时，通常会在采样后3 d内给出受照剂量，基本可以满足患者救治过程中对剂量评估的需要。但在应对大批量核辐射伤员的剂量估算时，其通量性明显不足，也不能适应事故现场救援的应用需求。

2.淋巴细胞绝对值分析技术：淋巴细胞数目快速下降是急性外照射损伤的主要临床表现之一，下降水平与受照剂量密切相关。照射后淋巴细胞下降的开始时间和下降程度与受照剂量及个体敏感性有关。在0.5 Gy以上照射12 h后，外周血淋巴细胞数量出现明显的下降，在0.5~10 Gy范围内，其下降程度与受照剂量呈正相关^[2-3]。

淋巴细胞绝对值分析用于辐射生物剂量估算最重要的优点是检测方法简单、快速，在一般医院的检验科室或实验室即可进行。目前，国内主要根据照射后12 h或24~48 h的淋巴细胞绝对数目估算受照剂量，适用范围为10 Gy以下。具体为：照射后24~48 h，轻(1~2 Gy)、中(2~4 Gy)、重(4~6 Gy)和极重度(6~10 Gy)骨髓性急性放射病对应的淋巴细胞绝对数(×10⁹/L)分别为1.2~0.9、0.9~0.6、0.6~0.3和0.3以下；照射后12 h检测，相应数值分别提高0.1^[4]。根据《血细胞参考区间》的行业标准^[5]，我国健康成人淋巴细胞绝对值参考区间为1.1~3.2×10⁹/L，下限值低于我国国标推荐的1 Gy照射后12 h和24~48 h对应的淋巴细胞绝对数值的下限(1.3×10⁹/L和1.2×10⁹/L)。所以，在受照剂量小于2 Gy的情况下，采用淋巴细胞绝对值分析存在一定的不准确性。

国外早先研究推荐照射后每隔2~3 h分析1次淋巴细胞绝对值，连续分析3~4次，根据动力学变化曲线估算受照剂量^[6]。Berger等^[7]推荐照射后48 h之内，每间隔8 h分析1次淋巴细胞数目绝对值，连续分析3次。有研究表明，照射后进行2次连续分析，根据2次淋巴细胞数目和采集时间间隔进行剂量估算^[8]，该方法适用于照射后18 h之内，两次采血最短时间间隔为2 h。

3.呕吐时间：呕吐是急性外照射损伤的早期反应之一。呕吐出现越早，呕吐越频繁，表明受照剂量越大。IAEA给出的原则是：10 min之内呕吐，剂量>8 Gy；10~30 min呕吐，剂量为6~8 Gy；30~60 min呕吐，剂量为4~6 Gy；1~2 h呕吐，剂量为2~4 Gy；2 h之后发生呕吐，剂量 < 2 Gy^[9]。与IAEA标准基本相同，我国的国家标准为：无呕吐，剂量 < 1 Gy；受照后2~3 h出现呕吐，剂量为1~2 Gy；照射后1~2 h开始呕吐，剂量为2~4 Gy；照射后1 h之内开始呕吐，剂量>4 Gy^[10]。

呕吐容易受到心理、情绪等因素影响，进行分析判断时需要具体分析，仅可作为已经确诊的急性放射病伤员剂量评估的参考方法^[8]。

在国内外多起放射性意外照射事故伤员的救治中，细胞遗传学分析方法、淋巴细胞绝对值分析及呕吐时间分析等方法综合运用，基本可以满足少量事故性伤员临床救治的剂量估算需要。随着日本福岛事故的发生和恐怖事件时有发生，发生大规模核与辐射事故和核恐怖袭击的风险日益增加，如何应对大批量核事故伤员的救治成为新的问题，针对事故早期的快速、高通量的检测技术成为辐射生物剂量计研究的新方向。细胞遗传学技术开始向自动化和高通量分析技术发展。外周血淋巴细胞γ-H2AX的作为放射损伤早期分子标志物，得到广泛认可，目前正开展快速检测技术的研究。分子生物学、组学技术和大数据分析技术的发展，从miRNA、代谢物等角度寻找新的放射损伤分子标志物，并开始探索多分子组合作为快速辐射生物剂量计的可行性。

1.细胞遗传学技术的自动化和高通量技术研究：最近几年，细胞遗传学技术主要向自动化和高通量方向发展。目前，基于中期分裂相自动扫描系统和染色体畸变自动分析软件的双着丝粒自动分析技术已经发展成熟，同时，细胞收获和标本制备也实现了自动化。从细胞收获、标本制备到双着丝粒分析的自动化，显著提高分析速度和通量，相关的设备和软件均已经商业化, 国内多家辐射生物剂量专业实验室已经拥有相关的仪器设备。

流式细胞分析作为高通量的检测技术，在淋巴细胞染色体畸变分析和微核检测方面亦有一定的进展。Beaton-Green等^[11]报道了一种改进的成像流式细胞分析技术(imaging flow cytometry，IFC)，大大提高了流式细胞分析双着丝粒染色体的准确性和分析通量。该技术中IFC软件的分析算法主要改进点是提高了对小目标(单条染色体和着丝粒)的识别计数特异性。其中，染色体培养和收获环节与传统方法相似，在低渗处理后，将染色体从悬浮液中释放分离出来，采用荧光探针标记染色体的着丝粒，通过IFC软件实现对单着丝粒、双着丝粒的区分识别。Rodrigues等^[12]报道一种基于流式细胞分析淋巴细胞微核的技术方法。该技术可以提升双核淋巴细胞微核的特异性，新的剂量-效应曲线中双核淋巴细胞的平均微核率与文献中使用自动计数方法的结果近似。此外，该技术方法还对估算剂量的准确性进行评估，即对9个血样进行0~4 Gy照射后，进行盲样自动分析(40 min)，每样品平均分析1 873个双核细胞。除0.75 Gy照射的样品外，其他8个样品的估算剂量与实际照射剂量之间的差别均不超过0.5 Gy，在保证准确度的同时，明显提高分析速度。

美国哥伦比亚大学研发的一套自动化分析淋巴细胞微核和淋巴细胞γ-H2AX的技术平台——RABiT系统(rapid automated biodosimetry tool，RABiT)，可实现外周血淋巴细胞微核和淋巴细胞γ-H2AX分析中样品制备、信号识别和数据分析的自动化，检测通量可达30 000人份/d^[13]。Repin等^[14]利用该技术平台，实现微量血的淋巴细胞微核分析，采用20 μl指尖血即可实现500个双核淋巴细胞分析，并利用8个志愿者的48 083个细胞建立了剂量上限为5 Gy的剂量效应曲线。

为了应对大批量核辐射伤员剂量估算的问题，在发展高通量分析技术的同时，世界卫生组织(WHO)于2007年倡导成立辐射生物剂量实验室网络^[15]。这一实验室网络通过对细胞遗传学技术制定规范、统一技术标准、操作流程，以及定期在不同实验室之间进行比对演练，实现不同实验室之间数据共享。辐射生物剂量实验室网络建立，一来对技术不发达国家建立辐射生物剂量估算实验室进行技术支持和帮助，另一方面通过在世界范围内提高辐射生物剂量估算技术，以应对可能发生的大规模核与辐射事故中伤员的医学应急。目前WHO、IAEA已经建立国际性的辐射生物剂量实验室网络，日本、韩国、加拿大等国家建立辐射生物剂量实验室网络，并多次开展比对演练^[16-20]。

2. γ-H2AX作为辐射生物剂量计的研究：随着分子生物学技术的发展，人们从蛋白和编码基因角度寻找放射损伤敏感分子，开启放射损伤分子标志物研究。近年来的研究发现，电离辐射诱导表达分子主要以应激响应分子、炎症因子、细胞凋亡和DNA损伤修复相关分子为主。DNA损伤分子不易受感染、应激等因素的影响，具有较好的放射损伤特异性，受到广泛的关注和研究，其中γ-H2AX的作为放射损伤分子标志物已经得到广泛的认可。

γ-H2AX聚集点分析作为放射损伤标志物的研究较为系统，已经利用小型猪、猕猴等动物模型证实体内外照射的一致性^[21-23]。利用人外周血淋巴细胞和动物模型开展较为系统的时间-效应和剂量-效应研究。γ-H2AX聚集点在照射后数分钟即开始增加，在照射后0.5~1 h(也有文献报道为2 h)达到峰值，而后逐渐下降，剂量响应下限可达0.02 Gy^[24]。猕猴实验表明，1 Gy照后2 d，即恢复到正常水平；8.5 Gy照后14 d，γ-H2AX聚集点水平仍明显高于正常值^[22]。γ-H2AX聚集点分析早期采用镜下计数的方法进行，检测通量较低，操作较为繁琐。Wang等^[25]建立了一种流式细胞分析外周血淋巴细胞γ-H2AX含量的技术，通过分析淋巴细胞与粒细胞中γ-H2AX含量的比值，解决直接分析淋巴细胞γ-H2AX方法的稳定性差问题，检测通量明显高于γ-H2AX聚集点的镜下分析方法。Moquet等^[26]建立一种96孔板快速检测外周血淋巴细胞γ-H2AX的方法，这种方法的分析时间大约4 h，明显少于常规方法，而且用血量仅为100 μl。欧洲的辐射生物剂量实验室网络已经将γ-H2AX分析作为基本方法，在网络成员之间进行推广和比对分析^{[19, 27]}。

3.代谢物作为放射损伤标志物的研究：近年来，代谢组学研究发展较快，代谢物作为放射损伤标志物的研究取得一定进展。Liu等^[28]对0.75、3和8 Gy照射后24 h的大鼠血清进行代谢组学分析，揭示9个代谢物可作为放射损伤的生物标志物，其中肌醇、丝氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸和甘油上调，而异柠檬酸、葡萄糖酸和硬脂酸下调。Johnson等^[29]对恒河猴进行1、3.5、6.5和8.5 Gy照射，在照射后3 d内的不同时间点收集其尿液，分析尿液中代谢物变化。该研究共发现9个新的代谢物作为放射损伤的生物标志物，其中一些标志物在小鼠和大鼠模型中同样被发现，如N-乙酰牛磺酸和羟乙磺酸等。Laiakis等^[30]首次分析骨髓移植患者移植前进行全身照射前后尿液中的代谢物变化，共发现7个在照射前后明显差异的代谢物(三甲基-L-赖氨酸、乙酰肉碱、癸酰肉碱、辛酰基肉碱、次黄嘌呤，黄嘌呤和尿酸)。随着代谢组学技术的发展，利用动物模型和临床患者的血清和尿液寻找放射损伤特异性标志物的研究较多，获得多种受放射调节的差异代谢物，可作为潜在的放射损伤标志物。与基因和蛋白标志物相比，代谢物更容易受到饮食、个体差异、性别和环境因素的影响^[31]。

4.血清miRNA作为放射损伤标志物的研究：相比蛋白、编码基因和代谢物的研究，miRNA作为放射损伤生物标志物的研究相对较少。Liu等^[32]利用细胞和小鼠模型对miRNA-34a作为放射损伤标志物进行研究，发现7 Gy照后4、8、24和48 h的小鼠血清中miRNA-34a水平均高于对照组，在照射后24 h为最高，48 h开始下降。Jacob等^[33]利用1~12 Gy不同剂量照射后24和48 h的血清以及骨髓移植患者照射前后的血清进行研究，发现多种进化保守的miRNA分子在照射后变化显著，其中血清中miRNA-150分子呈明显的剂量依赖和时间依赖性降低，被认为是反映骨髓损伤的良好分子标志物。Halimi等^[34]利用乳腺癌患者放射治疗前后血清研究发现，照射后血清中miRNA-21显著增加，用其区分受照人员的特异性达75%，灵敏度为80%。Acharya等^[35]利用小鼠模型，对小鼠进行6.5 Gy(亚致死)和8 Gy照射(致死)，分析两个剂量之间血清miRNA的差异。结果发现，与6.5 Gy照射小鼠相比，miRNA-30a-3p和miRNA-30c-5p在8 Gy照射后上调；miRNA-187-3p、miRNA-194-5p和miRNA-27a-3p在8 Gy照射后下调。同时采用移植人类CD34+细胞的小鼠进行照射，而后检测小鼠血清中上述4种miRNA的表达，结果表明，照射后小鼠血清中上述4种miRNA具有潜在的预测辐射对人类骨髓细胞损伤的作用^[35]。

5.多分子表达谱作为高通量生物剂量计的研究：随着组学技术的发展，大量放射响应分子被发现，从细胞系、外周血细胞、动物模型以及肿瘤放疗患者进行研究，获得一些可作为放射损伤分子标志物的放射敏感分子。放射损伤分子标志物在一定的剂量范围内多具良好的剂量-效应关系，但是普遍存在较强的时间依赖性，即同一照射剂量下，照射后不同时间其变化幅度不同。单一放射损伤分子标志物的时间依赖性，影响其评估剂量的准确性。近年来，研究人员开始探索用多分子表达谱作为高通量辐射生物剂量计的研究。

Marchetti等^[36]对近年来研究发现的受到电离辐射调节分子进行归纳总结，共发现261个蛋白分子在电离辐射后表达水平发生改变，并对其反应剂量和时间进行了分析，认为ATM、H2AX、CDCN1A、和TP53等基因作为生物剂量计具有潜力，同时提出了利用多分子组合的方式进行生物剂量估算。该方法选取20个电离辐射诱导表达蛋白分子，这些蛋白分子在不同剂量诱导后的不同时间具有各自的特异性有效剂量和有效的诱导时间，根据照射后特定时间内不同的蛋白分子表达水平进行剂量估算。

有研究利用基因芯片分析不同剂量照射外周血细胞基因表达谱的差异，分析这种表达谱的差异是否能作为放射损伤评估的方法。结果显示，0、50、200和1 000 cGy照射小鼠的外周血细胞基因表达谱存在明显的差异，这种差异性表达谱不仅可以在未受照小鼠和受照小鼠之间进行有效区分，而且可以在50、200和1 000 cGy 3个照射剂量之间进行有效区分，这种方法的准确度为90%，敏感度85%，特异性为94%^[37]。利用骨髓移植前照射150~200 cGy的患者血样，采集照前和照后6 h的样本进行验证，获得一组包含25个基因的基因组合，利用这组基因可以对是否受照进行有效区分，准确度为90%，敏感度是85%，特异性是94%^[37]。随后，该实验室证实这种差异基因表达谱的方法可对照射小鼠损伤评估，没有物种之间的差别，也可以有效区分照射损伤与LPS刺激，证实其放射损伤的特异性^[38]。2010年，该实验室再次发文，分析基因表达谱对局部照射的评估能力，同样取得令人满意的结果^[39]。针对上述研究，Park等^[40]开展进一步深入研究，分析人与非人灵长类动物外周血照射后的差异表达基因谱，通过二者之间共同变化的多个基因分子，建立一种利用非人灵长类在体照射的数据预测人类受照剂量的方法。

辐射生物剂量学研究是放射医学不可或缺的一部分，辐射生物剂量计在事故性放射伤员救治中的剂量评估和治疗方案的选择上发挥非常重要的作用。现有的细胞遗传学方法可以满足事故性伤员救治的需要，但是在大规模核与辐射事故伤员的应对方面还存在明显不足。今后，辐射生物剂量学的研究方向，从技术方面来说，细胞遗传学技术方法应当在对现有技术进行标准化的基础上，开展基于图像分析和流式细胞分析的技术研究，以实现高通量的自动分析技术。放射敏感分子，特别是血清中miRNA、代谢物和蛋白分子，可作为早期快速分类诊断技术进行研究。多分子表达谱分析，结合组学技术和生物信息学分析技术进行系统研究，作为高通量的快速剂量估算技术有好的应用前景。在辐射生物剂量学的学科发展方向方面，可在开展外照射伤员早期剂量估算技术的基础上，向下面几个方向发展：① 大规模核与辐射事故伤员现场快速分类诊断技术研究。② 低剂量照射剂量评估技术研究。③ 放射损伤远后效应早期预警技术研究。④ 放射致组织器官特异性损伤评估技术研究。通过上述研究，逐步建立完善放射生物剂量估算技术体系，应对不同类型的核与辐射事故伤员的现场医学应急、医院救治、以及受照人员远后效应评价的需求。