食管癌死亡率在我国所有恶性肿瘤中排第4位，大多数患者发现时已属中晚期^[1]。放射治疗是食管癌主要的治疗手段之一，放射抗拒是引起食管癌放射治疗失败的重要原因^[2]。如何提高食管癌放射敏感性，成为当前治疗食管癌的一个亟待解决的问题。生物信息学是近年来的热点研究工具，广泛应用于分子生物学各个领域，包括基因表达谱的分析、基因组序列信息、蛋白质序列和结构、代谢和疾病发生途径的信号通路研究等及相互作用分析^[3]。

本研究利用GEO2R分析来自基因芯片公共数据库(GEO)的食管癌放射抗拒相关芯片数据，获得差异表达基因，进一步利用DAVID、String等在线分析软件对这些差异基因进行Gene Ontology分析、Kegg Pathway分析及蛋白间相互作用的网络分析，从整体上筛选食管癌放射抗拒关键基因及信号通路，有利于进一步了解食管癌放射抗拒发生机制，为食管癌治疗开辟新思路。

1.细胞与试剂：TE13细胞系由西安交通大学第二附属医院实验室提供，具有放射抗拒性TE13R细胞系由本实验室构建并保存。RPMI 1640干粉购自美国GIBCO公司；胎牛血清购于美国Hyclone公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。

2.基因表达谱数据获取：放射抗拒食管癌及放射敏感食管癌细胞基因表达谱来源于NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，登录号分别为GSE61772和GSE61620，由Xiong等^[4]提交。GSE61772由6个样本构成，样本编号GSM1513731~GSM1513733放射敏感细胞组，GSM1513734~GSM1513736为放射抗拒细胞组；GSE61620由6个样本构成，GSM1509454~GSM1509456为放射敏感细胞组，GSM1509457~GSM1509459为放射抗拒细胞组。

3.差异表达基因的筛选：GEO2R是利用R语言中GEOquery和limma程序包，应用t检验筛选差异表达基因^[5]。本研究利用GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)在线分析软件筛选GSE61772和GSE61620中放射抗拒食管癌细胞及放射敏感食管癌细胞间差异表达基因。将GSE61772和GSE61620中获取的差异基因导入韦恩图(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线制作软件，获取共有的差异基因。基因表达谱数据具有高维度和小样本量的特点，需要多重假设检验(multipletest)控制，本研究中，多重假设检验控制采用Benjamin和Hochberg提出的假阳性率控制法^[6]。差异基因筛选标准：adjusted P < 0.05，Fold change即FC≥2。

4.差异基因生物信息学分析：进一步运用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在线分析软件对这些差异表达的基因进行GO BP分析、Kegg通路分析。采用改良Fisher精确检验的统计学方法，分析差异表达基因是否在某个功能节点上出现过，得出有显著关联的基因功能类或通路，按其P值排序后输出功能类表格，对这些基因进行生物学解释。P<0.05，计数>2具有统计学意义。进一步运用String(http://www.string-db.org/)在线分析软件对这些差异表达的基因进行Protein-Protein interaction分析。

5.细胞培养及RT-PCR方法检测CHN2基因表达变化：首先，将TE13和TE13R培养于含10%胎牛血清、250 μl青霉素、400 μl链霉素(购于上海碧云天公司)的RPMI 1640的培养基中，置于37℃、5% CO₂中，每2~3天更换培养液1次。待细胞80%~90%贴壁进行传代。其次，按照试剂盒说明分别检测CHN2在TE13和TE13R表达。内参照为GAPDH。凝胶成像仪获取图片，经Quantity One软件对CHN2基因与其内参进行灰度比值半定量比较。

1.食管癌放射抗拒相关基因的筛选：采用GEO2R对GSE61772和GSE61620中数据进行分析，GSE61772中发现有437个差异基因，GSE61620中发现有1 196个差异基因。进一步运用韦恩图在线分析软件对GSE61772和GSE61620中共有差异基因进行分析发现：两组数据中共有49个差异基因，其中上调表达37个，下调表达12个(表 1)。其中，前12个是在放射抗拒细胞中低表达基因，后面37个为高表达基因。

表 1(Table 1)

表 1 两组数据库中均有的49个差异表达基因 Table 1 A total of 49 differentially expressed genes in both two databases of GSE61772 and GSE61620 基因名称 基因描述 P值 NEDD4L 神经前体细胞，E3泛素蛋白连接酶 0.019 830 MRPL43 线粒体核糖核酸蛋白L43 0.022 488 LHX4 LIM同源4 0.031 918 CARMIL2 蛋白调节和肌球蛋白1连接 0.029 888 PDZD11 PDZ结构域11 0.031 277 SLC22A17 溶质载体家族22成员17 0.033 066 ERC1 ELKS/RAB6融合CAST家族1 0.019 067 TCEAL8 转录因子A8 0.009 730 CHRNA7 胆碱能受体alpha 7 0.021 421 PGLYRP1 肽聚糖识别蛋白1 0.012 412 CPA4 羧肽酶A4 0.016 291 VGLL1 残留家族r1 0.003 268 EPHA3 EPH受体A3 0.010 228 GPC4 磷脂酰肌醇蛋白4 0.004 216 KCNJ8 电压门控钾通道家族I成员8 0.022 263 CSNK1A1L 酪蛋白激酶alpha 1 0.009 492 SRGN 丝甘蛋白聚糖 0.002 215 CEP85 L 中心蛋白体85 0.009 837 TLN2 TL2 0.016 551 RGS7 G蛋白信号调节器7 0.002 462 OR1S2 嗅觉受体家族1亚家族S成员2 0.009 602 LIMCH1 LIM和调宁蛋白结构域1 0.005 191 SPINK1 Kazal型丝苷酸肽酶抑制剂1 0.044 314 DOCK2 致死性胞质分裂2 0.014 907 FAM3B 序列相似性3成员B 0.040 219 CGNL1 cingulin 1 0.005 380 SLCO5A1 溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员s 0.013 338 KCNK2 钾双通道亚家族K成员2 0.012 635 SPIN2B spindlin家族r2B 0.023 584 IL10RA 白介素10受体亚群alpha 0.021 373 CERS1 神经酰胺合酶1 0.008 890 CHN2 嵌合素2 0.007 667 CPVL 卵黄样羧肽酶 0.000 248 COL4A3 Ⅳ型胶原alpha 3链 0.026 215 BCL2 凋亡调节基因BCL2 0.019 430 PRICKLE1 棘平细胞极性蛋白1 0.007 600 LGSN 谷氨酰胺合成酶 0.024 654 ZNF705D 锌指蛋白705D 0.033 846 NR4A3 核受体亚族4成员3 0.038 708 TRPM3 瞬时受体电位阳离子通道亚族M成员3 0.020 113 LINC01309 长链非编码蛋白质RNA1309 0.024 638 GPR173 G蛋白偶联受体173 0.030 674 BICC1 BicC家族RNA结合蛋白1 0.029 566 MYOM1 肌球蛋白1 0.003 633 SPDYE1 speedy/RINGO细胞周期调节家族成员E1 0.022 604 OR6S1 嗅觉受体6家族S成员1 0.026 351 ANKRD1 锚蛋白重复结构域1 0.013 994 KCTD12 含钾通道四域化结构域12 0.008 311 LYPD6 LY6/PLAUR域6 0.018 546

表 1 两组数据库中均有的49个差异表达基因 Table 1 A total of 49 differentially expressed genes in both two databases of GSE61772 and GSE61620

2.共有的差异表达基因GO分析和Kegg通路分析：通过DAVID在线分析工具对49个共有差异表达基因进行生物信息学分析发现，差异基因参与生物学过程24条，主要集中在调节多细胞生物合成、离子转运、含氧化合物反应、DNA合成、代谢、调节细胞增殖、应激反应等，其中调节多细胞生物合成、离子转运、含氧化合物反应涉及基因较多(表 2)。差异基因参与主要生物学通路是Wnt信号通路，涉及基因是GPC4、PRICKLE1、CSNK1A1L。

表 2(Table 2)

表 2 共有的差异表达基因参与的生物学过程 Table 2 Biological processes regulated by the common differentially expressed genes 生物学过程 基因 参与基因数目 P值 调节多细胞生物发育 GPR173, GPC4, COL4A3, PRICKLE1, CARMIL2, BCL2, PGLYRP1, CHRNA7, NEDD4L, ANKRD1, KCNK2, SRGN, EPHA3 13 0.000 976 外界刺激反应 TRPM3, DOCK2, KCNJ8, IL10RA, BCL2, LHX4, PGLYRP1, CHRNA7, ANKRD1, MYOM1, KCNK2 11 0.049 261 离子转运 SLC22A17, TRPM3, KCNJ8, BCL2, PDZD11, SPINK1, CHRNA7, NEDD4L, SLCO5A1, KCNK2 10 0.010 013 含氧化合物反应 GPR173, COL4A3, CERS1, KCNJ8, IL10RA, BCL2, CHRNA7, ANKRD1, EPHA3 9 0.039 681 多细胞生物过程调控 GPR173, COL4A3, PRICKLE1, BCL2, PGLYRP1, CHRNA7, KCNK2, SRGN 8 0.014 233 含磷酸盐的复合代谢过程 CSNK1A1L 1 0.002 600 注：基因列出前5项

表 2 共有的差异表达基因参与的生物学过程 Table 2 Biological processes regulated by the common differentially expressed genes

3.共有的差异表达基因间相互作用网络分析：将49个基因导入在线分析软件String中发现12个基因间存在相互作用，分别是CPVL、CHN2、EPHA3、PRICKLE1、GPC4、COL4A3、OR6S1、OR1S2、KCNK2、KCNJ8、ZNF705D和CSNK1A1L。存在8条相互作用连接。其中CHN2与多个基因间存在相互作用(图 1)。

图 1 共有差异表达基因对应蛋白间相互作用 注：每个点代表对应蛋白，蛋白间每条不同线条连接代表预测的功能连接，线条颜色代表来自不同类型证据 Figure 1 Interactions of protein to protein corresponding to the common differentially expressed genes

4.CHN2在不同放射敏感性食管癌细胞系中基因表达变化：半定量RT-PCR结果显示，CHN2在TE13R细胞及TE13细胞中均有表达。CHN2的mRNA在TE13R及TE13细胞中的表达分别为0.46±0.04和0.51±0.12，差异无统计学意义(P>0.05)，见图 2。

图 2 CHN2在不同放射敏感性食管癌细胞系中基因表达变化 Figure 2 Expression of CHN2 in different esophageal carcinoma cell lines with different radiosensitivities

食管癌是最常见胃肠道肿瘤之一。放射治疗是食管癌主要且有效治疗方法之一，然而放射治疗临床效果却并不满意。放射抗拒是影响食管癌放射敏感性最大障碍之一^[7]。因此，寻找食管癌放射抗拒相关分子，探索其发生机制，针对每位患者制定个体化治疗方案显得尤为重要。随着人类基因组计划的完成及基因工程技术的发展，通过检测基因及蛋白预测，诊断疾病以及指导个体化治疗成为近来研究热点^[8]。关于食管癌放射敏感性相关的分子研究已有许多报道，但由于大多数分子标志物检测手段复杂、变化大，以至于大多数研究仍没有一致结果^[9]。

近年来采用生物信息学方法在分子水平上进行数据挖掘，为研究包括肿瘤在内的各种疾病的分子发病机制提供了新的思路^[10]。本研究利用GEO2R分析来自基因芯片公共数据库(GEO)的食管癌放射抗拒相关芯片数据，筛选差异表达基因；通过生物学过程注释、信号通路富集分析及蛋白质相互作用分析，以挖掘与食管癌放射抗拒相关基因及信号通路，在分子水平研究食管癌放射抗拒机制，为提高食管癌放射敏感性及个体化治疗提供依据。

GEO2R是一种源于R语言程序的分析基因差异表达工具。本研究利用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)在线分析工具分别分析GSE61772和GSE61620数据中放射抗拒食管癌细胞及放射敏感食管癌细胞间差异表达基因，进一步用韦恩作图工具选择两组芯片数据中共有差异基因，获得49个共有基因，其中12个是在放射抗拒细胞中低表达基因，37个为高表达基因。这些基因可能与食管癌放射抗拒相关，为食管癌放射抗拒发生有关基因提供理论基础。这些基因主要参与调节多细胞生物合成、离子转运、含氧化合物反应、DNA合成、代谢、调节细胞增殖、应激反应等，其中调节多细胞生物合成、离子转运、含氧化合物反应涉及基因较多，与以往研究一致^[11]。

经DAVID及Kegg数据库进行通路富集分析发现，所选基因主要参与Wnt信号通路。说明该信号通路可能在食管癌放射抗拒发生中发挥一定作用。有研究采用全基因芯片对食管癌放射抗拒细胞系及其亲本细胞比较，发现Wnt通路上有19个基因出现表达差异^[12]。Wnt高表达引起Wnt信号通路激活，导致β-联蛋白的积蓄，引起下游cyclin-D1和WISP1的高表达及细胞增殖加速，从而使食管癌细胞具有放射抗性。Wnt信号通路可能与食管癌放射抗拒发生相关^[13]。本研究发现Wnt信号通路上GPC4、PRICKLE1、CSNK1A1L基因在食管癌放射抗拒细胞系与放射敏感细胞间表达存在差异。

本研究进一步对共有差异基因进行蛋白相互作用网络分析，发现基因CPVL、CHN2、EPHA3、PRICKLE1、GPC4、COL4A3、OR6S1、OR1S2、KCNK2、KCNJ8、ZNF705D和CSNK1A1L间存在相互作用，其中CHN2是关键节点。CHN2活化在细胞增殖和迁徙中发挥重要作用。具有正向调控GTP活性作用，CHN2基因参与代谢过程。这些功能可能与食管癌放射敏感性相关，仍需进一步证实。本研究采用RT-PCR技术检测CHN2在不同放射敏感性食管癌细胞系中基因表达变化，结果显示在TE13R细胞及TE13细胞中均有表达，其在不同放射敏感性食管癌细胞中表达差异无统计学意义。后期研究笔者将通过检测食管癌患者放疗前活检标本中CHN2表达，探讨其与食管癌放射敏感性关系，为CHN2在食管癌患者放射治疗中价值做出评估。总之，本研究进一步证实了放射抗拒发生是多基因共同参与结果。目前关于上述这些基因与放射抗拒间关系未有报道，这些基因仍需进一步研究。

综上所述，本研究通过对GEO中食管癌放射抗拒相关芯片数据进行生物信息学分析，发现Wnt信号通路可能是食管癌放射抗拒发生过程中重要的信号通路；筛选出49个差异基因可能与食管癌放射抗拒发生相关，基因CHN2可能与食管癌放射抗拒发生相关。总之，利用生物信息学方法能够能有效地筛选和再次分析基因芯片数据，挖掘食管癌放射抗拒关键分子及通路，为筛选食管癌放射抗拒相关分子及食管癌个体化治疗开辟了新的思路。后续研究中，课题组将会对本研究中筛选的基因在食管癌患者放射治疗中价值做出评估。