随着核技术和电离辐射的广泛应用,人们对于重大事故导致的高剂量电离辐射诱导急性放射损伤有着深刻认识,而对长期持续低剂量辐射产生的健康效应存在争议。联合国原子辐射影响科学委员会(UNSCEAR)2010年报告规定,剂量低于200 mGy、 剂量率低于0.1 mGy·min^-1(1 h以内或1 h以上的平均剂量率)的X或γ射线外照射剂量为低剂量。低剂量辐射的研究结果对放射防护实践中人群健康影响的评价以及放射防护法规的制定有重要的指导意义。广东阳江天然高本底辐射地区(high background radiation areas,HBRA)位于我国东南沿岸广东省阳江市所属的阳东县和阳西县,据测量该地区地表γ辐射水平约为对照地区的3倍^[1-2],这种天然高本底环境形成了一个长期低剂量电离辐射健康效应的良好研究现场。

miRNAs是一类长度为19~23个核苷酸的内源性非编码小分子RNA,通过与靶mRNA结合在转录后水平调控基因的表达,进而参与调节辐射诱导的DNA损伤与修复、 基因表达改变、 细胞周期阻滞、 细胞癌变和死亡等多种细胞效应^[3]。国内外对于辐射所致miRNAs表达改变的研究主要集中在体外细胞系和动物实验研究,其中miR-16、 miR-106b、 miR-34a、 miR-449a和let-7g的表达情况受辐射影响变化较为明显^[4-6],而辐射尤其是低剂量辐射对人体外周血血浆miRNAs表达影响的直接观察资料较少。本研究以高本底地区居民为研究对象,选取miR-16、 miR-106b、 miR-449a、 miR-34a和let-7g 5个辐射相关的miRNAs,探讨长期低剂量辐射对其在暴露者血浆中表达的影响。

1. 研究对象:采用单纯随机抽样,选择阳江天然高本底辐射地区的55名50岁以上的女性居民作为研究对象,要求在阳江市阳西县本地居住15年以上,另外从邻近的经济文化水平及生活习惯相似的恩平市采用单纯随机抽样方法选择55名50岁以上长期居住的女性居民作为对照人群。患有恶性肿瘤、 严重慢性病、 急性感染性疾病及最近1个月内有服药史者除外。高本底地区居民接受外照射(主要是地表γ辐射)和内照射(主要是氡钍射气及其子体)的年有效剂量分别为3.1和4.27 mSv/年;对照地区居民所接受的外照射和内照射的年有效剂量分别为0.85和1.65 mSv/年,高本底地区约为对照地区的3倍^[1-2]。全部研究对象自愿参加并签署知情同意书。

2. 问卷调查:采用自行设计的调查问卷由经过培训的当地调查员进行面对面调查,内容主要包括调查对象的年龄、 身高、 体重、 职业和文化程度等一般情况;高本底地区女性居民出生地及何时嫁入现居住地等居住情况;疾病史以及医疗照射史等健康情况;饮食、 吸烟、 饮酒等生活习惯等。调查员均经过统一培训,调查过程中均使用规范化语言并于调查结束后自查问卷。

3. 个人累积剂量估算:参照文献^{[2, 7]}所采用的计算方法,根据环境γ外照射辐射水平,采用以下公式估算每个居民平均年有效剂量:

式中,E为居民年有效剂量,10^-5Sv/年;K_a,bedroom为住户床上的自由空气比释动能平均值,10^-8 Gy/年;K_a,indoor为住户室内自由空气比释动能平均值,取厨房和起居室的平均值,10^-8 Gy/年;K_a,outdoor为住户室外自由空气比释动能的平均值,取村内公共场地和田野的平均值,10^-8 Gy/年;f_bedroom为每天床上停留时间,h; f_indoor为每天室内停留时间,h; f_outdoor为每天室外停留时间,h;θ_age为由γ射线所引起的空气中的比释动能估算人员有效剂量的转换系数,与年龄相关,根据UNSCEAR 1993年报告,0~1 岁,0.93;1~19 岁,0.8;≥20 岁,0.72;2.59为宇宙射线电离成分在室内的空气比释动能,10^-8 Gy/年;2.88为宇宙射线电离成分在室外的空气比释动能,10^-8 Gy/年;365为一年的天数;23.7为当地宇宙射线所致年有效剂量,10^-5Sv/年。

此外,由于大部分研究对象出生地和现居住地不一致,在估算每名女性居民的外照射累积受照剂量时,还要根据出生地和现居住地的平均年有效剂量水平和居住时间的不同分别进行计算,然后累积相加得出。

4. 血样处理及总miRNA提取:乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)抗凝真空采血管收集调查对象静脉血,冷藏保存带回实验室,静置30 min后2 500 r/min,离心半径147 mm,离心5 min,收集上清液于离心管中,用低温记号笔做好标记,置于-80℃冰箱中长期保存。用TRIzol LS试剂和miRNeasy试剂盒(德国Qiagen公司)提取每个样品血浆中总miRNAs(提取时加入4.5 μl,50 fmol/μl的cel-miRNA-39做外源性内参)。

5. 引物设计与合成:miRNAs引物及探针由美国ABI公司TaqMan miRNA assays试剂盒提供,序列分别为:cel-miR-39:5' UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG 3';hsa-miR-16:5' UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 3';hsa-miR-106b:5' UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU 3';hsa-miR-34a:5' UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 3';hsa-miR-449a:5' UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU 3';hsa-let-7g:5' UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 3'。

6. miRNAs的定量检测:首先以总miRNAs为模板用TaqMan miRNA反转录试剂盒(美国ABI公司)合成cDNA,反应体系为:100 mmol／L dNTP,0.1 μl;反转录酶,0.5 μl;10×反转录缓冲液,0.75 μl;RNA酶抑制剂,0.1 μl;miRNA反转录引物(TaqMan miRNA assays试剂盒,美国ABI公司),0.5 μl;miRNA,2.0 μl,加水补足7.5 μl。反应条件为:16℃ 30 min,42℃ 30 min,85℃ 5 min。随后使用QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)检测miR-16、 miR-106b、 miR-34a、 miR-449a以及let-7g的表达水平。RT-PCR反应条件为:95℃,10 min预变性;95℃,15 s变性;60℃,1 min退火延伸;45个循环进行扩增。以cel-miR-39作为实验外源性内参,每个样品重复3次,2^-ΔCt表示经内参标化后的miRNAs的相对表达量,其中Δ Ct=靶miRNAs的平均Ct值－内参的平均Ct值。

7. 统计学处理:使用SPSS 22.0软件进行分析,对两组的年龄、 个人累积剂量和BMI指数进行正态性检验表明服从正态分布,采用t检验进行比较;高本底组和对照组各个miRNA的相对表达水平的正态性检验表明不服从正态分布,采用Mann-Whitney U检验进行比较;选择剂量、 年龄和体质量指数(BMI)等变量,采用进入法进行多因素回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

1. 基本情况分析:结果列于表 1。由表 1可知,高本底地区居民个人累积剂量为152.18~239.19 mSv,是对照地区31.45~56.05 mSv的4倍。高本底地区和对照地区平均年龄分别为(68.38±9.86)和(60.00±8.38)岁。个人累积剂量和年龄在高本底和对照组之间的差异有统计学意义(t=42.803、 4.804,P<0.05),而两组的BMI差异无统计学意义(P＞0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 高本底地区和对照地区居民基本情况表(x±±s) Table 1 Basic situation of residents at high background area and control area(x±±s) 组别 例数 年龄(岁) 体质量 指数 个人累积剂量 (mSv) 对照组 55 60.00±8.38 22.43±3.57 42.59±6.57 高本底组 55 68.38±9.86 21.30±2.76 182.47±23.33 t值 4.804 -1.865 42.803 P值 <0.001 0.065 <0.001

表 1 高本底地区和对照地区居民基本情况表(x±±s) Table 1 Basic situation of residents at high background area and control area(x±±s)

2. miRNAs表达情况:结果列于表 2。由表 2可知,与对照组相比,miR-16、 miR-106b在高本底组外周血血浆中的表达水平降低,而miR-449a的表达水平升高,在两组间表达水平的差异具有统计学意义(Z=-2.968、 -2.089、 -2.043,P<0.05)。miR-34a和let-7g在两组间表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 miRNAs在高本底组和对照组居民血浆中的表达情况 Table 2 The expressions of miRNA in the plasma of residents in high background and control group 组别 miRNAs 例数 2-ΔCt (中位数) Fc(高本底组/ 对照组) 对照组 miR-16(×10-3) 55 2.008 — miR-106b(×10-5) 55 3.841 — miR-34a(×10-6) 55 0.767 — miR-449a(×10-6) 21 1.183 — let-7g(×10-5) 55 1.463 — 高本底组 miR-16(×10-3) 55 1.165a 0.580 miR-106b(×10-5) 55 2.764a 0.719 miR-34a(×10-6) 55 0.943 1.229 miR-449a(×10-6) 11 1.846a 1.560 let-7g(×10-5) 55 0.978 0.668 注：Fc表示倍数变化；“—”表示无数据。a与同一miRNAs对照组比较，Z=-2.968、 -2.089、 -2.043，P<0.05

表 2 miRNAs在高本底组和对照组居民血浆中的表达情况 Table 2 The expressions of miRNA in the plasma of residents in high background and control group

3. miRNAs表达影响因素分析:采用多因素回归分析方法分析所有受检者外周血血浆中miRNAs的表达水平与影响因素(累积剂量、 年龄、 BMI)的关系。将个人累积剂量、 年龄和BMI采用进入法纳入回归方程中进行拟合,结果列于表 3。由表 3可知,控制年龄和BMI指数等因素后,受检者外周血血浆中miR-16和miR-106b的相对表达水平(用2^-ΔCt表示)与个人累积剂量成负相关(P<0.05),即随着个人累积受照剂量的升高,两个miRNAs的相对表达水平降低。而在控制年龄和BMI指数因素后,miR-449a、 miR-34a和let-7g的相对表达水平与个人累积剂量的回归关系无统计学意义(P＞0.05),尚不能认为这3种miRNAs的表达水平改变与高本底暴露有关。

表 3(Table 3)

表 3 miRNAs表达水平影响因素的多重线性回归分析 Table 3 Multiple linear regression analysis of influencing factors on miRNA expression 模型 回归系数 b 标准误 Sb 标准化偏 回归 系数β t值 P值 miR-16 常量 8.683 0.259 — 33.510 0.000 累积剂量 0.005 0.002 0.243 2.606 0.010 年龄 0.026 0.018 0.030 0.270 0.787 BMI -0.017 0.046 -0.017 -0.174 0.862 miR-106b 常量 14.429 0.241 — 59.910 0.000 累积剂量 0.004 0.002 0.208 2.205 0.030 年龄 0.059 0.017 0.069 0.608 0.545 BMI 0.010 0.043 0.010 0.100 0.920 miR-449a 常量 22.369 4.500 — 4.971 0.000 累积剂量 -0.008 0.006 -0.293 -1.445 0.159 年龄 0.012 0.045 0.061 0.269 0.790 BMI 0.038 0.121 0.066 0.315 0.755 miR-34a 常量 20.658 1.643 — 12.572 0.000 累积剂量 -0.001 0.002 -0.076 -0.641 0.523 年龄 0.005 0.018 0.036 0.292 0.771 BMI -0.029 0.047 -0.066 -0.628 0.532 let-7g 常量 14.844 1.662 — 8.932 0.000 累积剂量 0.003 0.002 0.140 1.217 0.226 年龄 0.006 0.018 0.042 0.351 0.726 BMI 0.034 0.047 0.074 0.732 0.466 注：BMI.体质量指数; “—”表示无数据

表 3 miRNAs表达水平影响因素的多重线性回归分析 Table 3 Multiple linear regression analysis of influencing factors on miRNA expression

本研究通过比较两组miRNAs的相对表达水平发现,与对照组相比,血浆中miR-16、 miR-106b和let-7g在高本底组的表达水平降低,而miR-449a和miR-34a在高本底组的表达水平则升高。将个人累积剂量、 年龄和反映营养情况的BMI指数等因素纳入多重线性回归分析模型中分析后显示,在控制年龄和BMI两个因素影响后,5个辐射反应相关的miRNAs中,仅miR-16和miR-106b的表达改变与个人累积剂量成负相关关系,而对于miR-449a、 miR-34a和let-7g的表达改变还不能认为与长期低剂量辐射相关。

电离辐射是一种物理损伤因素,其产生的生物效应主要源于射线与组织细胞的相互作用。与高剂量照射相比,低剂量照射诱导的生物效应和基因调控网络的类型、 程度和结局等方面有其自身特点。Maes等^[8]发现,在不同剂量(0.1和2 Gy)的X射线照射后,人正常成纤维细胞中miR-92b等6个辐射相关的miRNAs表达谱是不同的。Chaudhry等^[9]研究表明,miR-16在受到0.5 Gy低剂量X射线照射的TK6细胞中表达上调,而在剂量为2 Gy的高剂量照射后表达变化则相反;同样,血浆中miRNAs在不同剂量下的表达谱也不相同。Simone等^[10]用不同剂量(从0.25到10 Gy)γ射线照射小鼠后,分析外周血血浆中的miRNAs表达情况发现,let-7a和let-7b在0.25~1 Gy表达具有剂量依赖性,即随着照射剂量的升高,两者的表达水平降低,而在更高剂量区间内未呈现剂量依赖性降低现象。本研究也发现,受到长期低剂量照射的人外周血血浆中miR-16和miR-106b的相对表达水平与个人累积照射剂量成负相关关系,但刘春旭等^[11]对氡温泉周围居民的研究结果显示,氡温泉居民外周血血浆中miR-16、 miR-106b、 miR-449a和let-7g的表达均上调,其原因可能是氡及其子体衰变过程产生的α粒子辐射为高传能线密度(LET)辐射,而本研究中的高本底地区主要是地表γ辐射,为低LET辐射。Chauhan等^[12]认为,高LET辐射可能激活与低LET辐射不同的生物效应途径。因此,本研究发现两个miRNAs表达的剂量依赖特性,虽为其作为低剂量辐射的生物标志物提供了可能,但其灵敏性和特异性仍需进一步扩大样本量以及在体外实验中证实。

miR-16和miR-106b主要通过负调节靶基因参与辐射诱导的细胞凋亡和周期阻滞过程。Liu等^[13]通过miRNA表达数据库反向筛选发现,Cyclin D1、 Cyclin E1、 CDK4/6和Bcl-2等细胞周期与凋亡相关因子受miR-16家族调控。Ivanovska等^[14]则应用微阵列分析证明p21基因为miR-106b的直接靶目标,miR-16和miR-106b的表达下调会进一步促进其靶基因的表达,促进或抑制细胞周期进程,从而影响细胞增殖或凋亡,这对肿瘤的发生发展起了关键的调控作用。但这种低剂量电离辐射长期作用下所致的细胞周期进程改变,通过人体自身稳定和修复功能,在一定剂量范围内不会出现对机体有害的健康效应。事实上,对高本底地区的癌症风险相关研究也确实未发现实体癌超额相对危险与剂量有关^[7]。因此,本研究关注的辐射效应指标miRNAs的表达改变对于描述高本底地区或其他相同辐射类型长期暴露人群的早期健康影响具有重要意义。大多数miRNAs的功能是改善基因表达,从而使细胞能够更加快速灵活的应对环境改变,miR-16和miR-106b在低剂量辐射效应中的基因调控网络以及下调的机制还需进一步研究和论证。

本研究中的其他3个miRNAs let-7g、 miR-449a和miR-34a的相对表达水平虽未表现出与个人累积剂量有关,但也不能忽视这部分信息。尤其是miR-449a在两组之间的表达差异是具有统计学意义的,而在回归分析中却未发现与低剂量辐射暴露有关,这可能与其在血浆中的表达量较低(高本底组有21个样本有表达,对照组有11个样本有表达)或样本量过小有关。且目前关于miR-449a与电离辐射的研究报道也很少,这部分信息有待进一步挖掘。let-7g和miR-34a是辐射所致细胞效应中研究较热门的miRNAs。let-7家族通过调节靶基因RAS参与保护受到电离辐射的细胞以及促进细胞增殖^[15]。miR-34a也被证明通过调节靶基因p53,参与辐射损伤时的细胞周期阻滞、 增殖抑制以及凋亡等细胞生命过程^[16]。对这两个miRNAs出现的阴性结果也应该谨慎处理,应扩大样本含量进一步探讨研究。

由于高本底地区男性多外出务工,具有吸烟和饮酒等混杂因素的比例较高,因此,为了计算长期的累积剂量以及观察长期低剂量辐射的生物效应,本研究纳入的研究对象均为50岁以上女性居民。此外,年龄在两组之间的差异有统计学意义,这种差异在两个地区的前期研究中发现是客观存在的^[7]。Ameling等^[17]研究发现,血浆中部分miRNAs的表达水平与年龄、 性别和BMI有关,但未包括本研究讨论的5种miRNAs。虽然在数据分析过程中采用多因素分析控制年龄和BMI等变量分析个人累积剂量与miRNAs表达水平的关系,但若进行低剂量辐射健康影响的生物标志物研究,还应丰富研究对象的多样性,尽量选取符合纳入条件的男性进一步研究。

综上所述,miR-16和miR-106b在高本底地区居民血浆中的表达水平下调且与个人累积剂量有负相关关系,具有作为长期低剂量辐射健康影响早期标志物的潜在价值,需要扩大样本量深入研究及在体外实验研究中进一步证实。