近年来，低剂量轻稀土元素在医学、生物学、药学等方面应用较为广泛，其抗氧化作用逐渐被人们认可。已发现铈(Ce³⁺)在氧化氛围中易被氧化为Ce⁴⁺，具有还原性，有研究显示氧化铈的纳米颗粒能保护正常细胞，避免由射线引起的肺部损伤。Ce³⁺能降低活性氧水平，提高超氧化物歧化酶-2的活性和生成^{[1 - 3]}。电离辐射可诱导机体产生大量的自由基和活性氧基团，这些基团对机体产生氧化损伤，是辐射对机体损伤的重要机制之一。本室前期研究发现，照射前给予氯化镧、碳酸铈均有提升小鼠白细胞的作用^[4]。本研究拟进一步观察纳米氧化铈对γ射线诱导小鼠免疫系统损伤的影响。

1. 实验动物： 实验用SPF级BALB/c小鼠120只，雄性，4～6周龄(北京维通利华公司)，实验动物许可证号SCXK(京)2011-0039。SPF级动物房饲养，自由饮水。

2. 主要试剂：纳米氧化铈(纯度99.99%、粒径30～50 nm，广州惠州瑞尔化学科技有限公司)，用5‰羧甲基纤维素纳溶液将纳米氧化铈粉末配制成3种剂量的混悬液。

3. 实验分组：将雄性BALB/c小鼠120只按随机号法分为健康对照组、照射组、阳性药物组(氨磷汀 200 mg/kg)及纳米氧化铈100、300和900 mg/kg组，共6组，每组20只。分别于照射后3和8 d活杀取材。照射前两周和照射后1周连续经口腔灌胃给药。

4. 照射条件：动物按组分别装进照射盒内，照射剂量为3.5 Gy，吸收剂量率1 Gy/min(北京师范大学辐照中心)，全身一次均匀照射。

5. 流式细胞术检测胸腺淋巴细胞凋亡率：分别于照射后3和8 d后，处死小鼠，取出胸腺，用PBS溶液冲出淋巴细胞。每管收集淋巴细胞，为10⁷/ml。分别向各管中加入1 ml溶血素，室温避光5 min，离心半径15 cm，1 000 r/min室温离心5 min，弃上清。每管加入1 ml 0.01 mol/L PBS重悬细胞液。加入5 μl Annexin V-FITC(南京凯基生物公司)和5 μl 碘化丙啶(美国Sigma公司)，混匀，室温避光孵育20 min。上机前用300目尼龙网过滤细胞。流式细胞仪(美国BD公司)用Cell Quest Pro软件(美国BD公司)建立双色荧光采集模板收集细胞，每个门内收集5×10⁴细胞。

6. 流式细胞术检测外周血淋巴细胞因子白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)：小鼠眼球取血，肝素钠抗凝。取全血标本200 μl，加入不含胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)200 μl，加入刺激剂Leukocyte activation cocktail(美国BD公司)1 μl，混匀。37℃，5% CO₂，培养4～6 h。每管加入3 μl Percp-CD₄(美国BD公司)，室温避光15 min，进行荧光标记。加入250 μl Fixation/Permeabilizaion(美国BD公司)溶液，4℃，20 min，进行固定破膜。250 μl Perm/Wash buffer洗1遍(或3 ml PBS洗)，弃上清。每管加入2 ml 1×溶血素，室温避光，10 min，弃部分上清液。保留上清液约100 μl，加入PE-IL-2(4 μl)和FITC-IFN-γ(1～2 μl)，混匀，室温避光，15 min。每管加入3 ml PBS，离心半径15 cm，1 200 r/min，离心5 min，弃上清液。0.5 ml PBS重悬细胞，上机检测。

7. 自然杀伤(NK)细胞活性测定：混合孔为脾淋巴细胞悬浮液(效应细胞，5×10⁶/ml)和Yac-1细胞(小鼠淋巴瘤细胞即靶细胞，1×10⁶/ml)各100 μl；另设效应细胞孔(脾淋巴细胞和靶细胞孔悬浮液各100 μl，5×10⁶/ml加DMEM完全培养基100 μl(美国 GIBCO公司)，加入不同浓度的纳米氧化铈溶液，孵育90 min。每孔加入二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液(10 μl，5 g/L)，继续培养4 h，离心半径15 cm，3 000 r/min 离心10 min，弃上清，每孔加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，充分震荡后570 nm处测定A值。根据下式计算NK细胞活性：NK细胞活性=(A_靶+A_效-A_混合)/A_靶×100%。

8. 统计学处理：数据以x±s表示。采用SAS 9.1软件进行数据分析。小鼠胸腺淋巴细胞凋亡率和死亡率数据方差不齐，采用秩和检验进行分析。细胞因子IL-2和IFN-γ阳性率和NK细胞活性数据满足方差齐性要求，采用t检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

1. 纳米氧化铈对小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的影响：由表 1可知，照射后3 d，与健康对照组相比，照射组小鼠胸腺淋巴细胞死亡率明显升高(F=7.10，P＜0.05)；细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均有增高的趋势。与照射组比较，纳米氧化铈各剂量组的细胞死亡率均降低，纳米氧化铈300 mg/kg组差异有统计学意义(F=4.50，P＜0.05)；细胞死亡率低于阳性药物组，但细胞凋亡率除纳米氧化铈100 mg/kg组的晚期凋亡率显著降低外(F=2.90，P＜0.05)；其余剂量组凋亡率均升高；阳性药物组的细胞早期凋亡率有降低的趋势，晚期凋亡率有升高的趋势，差异均无统计学意义(P＞0.05)。受照后8 d，与健康对照组比较，照射组小鼠胸腺淋巴细胞死亡率、早期和晚期凋亡率仍明显升高(F=4.33、4.45、5.91，P＜0.05)。与照射组比较，纳米氧化铈900 mg/kg组的细胞死亡率明显降低(F=4.07，P＜0.05)；阳性药物组的细胞早期凋亡率亦显著下降(F=3.48，P＜0.05)；纳米氧化铈100 mg/kg组的细胞早期凋亡率显著下降(F=3.47，P＜0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠受照后不同时间胸腺淋巴细胞的凋亡率(%，x±s) Table 1 Apoptosis rate of thymus lymphocyte in mice at different time after irradiation(%，x±s) 组别 只数 受照后3 d 受照后 8 d 死亡率 早期凋亡率 晚期凋亡率 死亡率 早期凋亡率 晚期凋亡率 健康对照组 5 0.91±0.77 0.31±0.36 0.40±0.18 0.97±0.42 0.82±0.28 1.25±0.38 照射组 5 11.74±7.94a 0.45±0.33 0.73±0.69 6.84±2.87a 5.40±3.09a 80.32±5.51a 阳性药物组 5 9.55±7.35 0.37±0.19 1.17±1.28 9.28±0.64 2.16±0.83b 83.60±1.83 纳米氧化铈 100 mg/kg组 5 6.75±2.83 1.35±0.50 0.34±0.23b 8.34±8.71 1.98±1.11b 40.73±38.44 300 mg/kg组 5 2.38±0.40b 1.23±1.12 2.16±1.97 4.85±4.70 7.67±3.79 50.50±10.81 900 mg/kg组 5 5.45±2.47 2.51±1.60 4.09±2.15 1.02±0.98b 5.04±1.48 46.17±12.43 注：a与健康对照组比较，F =7.10、4.33、4.45、5.91,P＜0.05;b与照射组比较，F =4.50、2.90、4.07、3.48、3.47,P＜0.05

表 1 各组小鼠受照后不同时间胸腺淋巴细胞的凋亡率(%，x±s) Table 1 Apoptosis rate of thymus lymphocyte in mice at different time after irradiation(%，x±s)

2. 纳米氧化铈对小鼠外周血细胞因子IL-2、IFN-γ的影响：由表 2可知，受照后3 d，与健康对照组相比，照射组小鼠外周血细胞因子IL-2阳性表达呈上升趋势，IFN-γ阳性表达也增加，差异有统计学意义(t=6.63，P＜0.05)。与照射组比较，纳米氧化铈各剂量组和阳性药物组的细胞因子IL-2阳性表达均有下降趋势，差异均无统计学意义(P＞0.05)；纳米氧化铈300 mg/kg组的IFN-γ阳性表达显著增多(t=2.26，P＜0.05)，而阳性药物组的IFN-γ的表达却显著减少(t=4.45，P＜0.05)。受照后8 d，与健康对照组相比，照射组小鼠外周血细胞因子IL-2、IFN-γ的阳性表达仍未恢复到正常水平。与照射组相比，纳米氧化铈各剂量组的细胞因子IL-2阳性表达均呈降低的趋势，但纳米氧化铈300 mg/kg组的IFN-γ表达显著增多，较阳性药物组更为明显(t=2.47，P＜0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 受照后不同时间各组小鼠外周血细胞因子IL-2、IFN-γ 的阳性表达（%,x±s） Table 2 Positive expression of mice peripheral blood cytokines IL-2, IFN-γ at different time after irradiation（%,x±s） 组别 只数 受照后3 d 受照后 8 d IL-2阳性率 IFN-γ阳性率 IL-2阳性率 IFN-γ阳性率 健康对照组 5 0.68±0.37 0.11±0.12 15.2±5.39 19.49±16.12 照射组 5 1.05±0.75a 1.72±0.53 11.49±3.03a 7.96±4.19a 阳性药物组 5 0.33±0.17 0.46±0.35 5.85±1.81 4.35±2.11b 纳米氧化铈100 mg/kg组 5 0.30±0.06 1.41±0.91 5.87±3.48 2.29±0.42b 300 mg/kg组 5 1.83±1.77 7.46±5.75b 7.35±1.21 23.25±14.62b 900 mg/kg组 5 0.87±0.49 5.41±4.14 6.32±1.93 10.74±7.41 注：IL-2. 白细胞介素；IFN-γ。 干扰素-γ。a与健康对照组比较，t =6.63,P ＜0.05;b与照射组比较，t =4.45、2.26、2、47,P ＜0.05

表 2 受照后不同时间各组小鼠外周血细胞因子IL-2、IFN-γ 的阳性表达（%,x±s） Table 2 Positive expression of mice peripheral blood cytokines IL-2, IFN-γ at different time after irradiation（%,x±s）

3. 纳米氧化铈对NK细胞活性的影响：受照后8 d，与健康对照组相比，照射组小鼠NK细胞活性明显降低(t=2.30，P＜0.05)。与照射组(14.06±1.15)比较，纳米氧化铈各剂量组(17.84±1.15)、(19.98±2.44)、(17.44±2.34)和阳性药物组(19.12±1.52)的NK细胞活性均显著升高，差异均有统计学意义(t=3.40、5.40、3.40、5.20，P＜0.05)，其中以纳米氧化铈300 mg/kg组提升NK细胞活性的作用更为明显，较阳性药物组稍好。

目前已有不少研究发现稀土在增强免疫功能、提高酶活性、抗氧化作用等方面效果明显。免疫系统对电离辐射极度敏感，其急性反应主要表现为淋巴细胞和免疫活性细胞数量减少、抗体形成抑制、细胞因子网络调节失常，最终导致免疫功能障碍和低下，继而引发一系列并发症^{[5 - 9]}。一定剂量的电离辐射可对机体多种器官和细胞产生损伤作用，其中血细胞和免疫细胞最为敏感，纳米氧化铈颗粒在氧化环境中的还原性能否为辐射损伤的免疫细胞带来保护，促进损伤后恢复是本实验主旨所在。因此，选择小鼠胸腺淋巴细胞凋亡率、外周血细胞因子IL-2、IFN-γ和NK细胞活性4项指标，观察纳米氧化铈对受照后小鼠免疫功能的影响。目前认为，辐射诱导细胞凋亡乃至死亡是由于DNA损伤导致。根据凋亡检测发现，受照小鼠胸腺细胞凋亡率受照后3 d比受照后8 d有增多的趋势，有文献表明，经6 Gy γ射线照射，小鼠淋巴细胞的凋亡率逐渐升高，7 d至最高^[10]，本研究结果与其相近。与照射组比较，经纳米氧化铈处理后的各组胸腺淋巴细胞死亡率下降，受照后8 d的凋亡率也呈下降趋势，尤其是纳米氧化铈100 mg/kg组降低凋亡率的作用较阳性药物组更优，表明纳米氧化铈有一定降低凋亡和死亡细胞的作用。以上结果是否表明纳米氧化铈对DNA有保护作用或是促进其修复，还有待进一步实验验证。

细胞因子具有介导调节免疫、炎症和造血的功能，IL-2和IFN-γ是淋巴细胞分泌的细胞因子中的重要成员，IL-2能够促进T细胞增殖，在T细胞活化、信号转导的过程中发挥重要作用，IFN-γ具有激活细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞作用，提升两者的杀伤能力。从外周血细胞因子IL-2、IFN-γ阳性表达的变化可知，不论受照后3 d还是8 d，纳米氧化铈均能够刺激胸腺淋巴细胞分泌、表达IFN-γ，提升淋巴细胞的杀伤能力，而IFN-γ主要由T细胞和NK细胞分泌，这与纳米氧化铈提升NK细胞活性的结果是一致的，因而进一步证明了纳米氧化铈具有保护免疫细胞、维持其功能的作用，纳米氧化铈300 mg/kg组的作用优于阳性药物组，但对刺激淋巴细胞增殖的IL-2的作用不明显。因此，纳米氧化铈对淋巴细胞的增殖能力影响不大，但对免疫细胞的杀伤能力具有一定的保护作用，进而提升受照小鼠免疫系统的防御功能。由于现有抗辐射药物多数都具有提升受照机体免疫系统的防御功能，故推测纳米氧化铈具有一定的辐射防护作用。

稀土对辐射损伤的影响目前研究报道还比较少，本课题组前期对氯化镧和氯化铈进行了实验观察，证实其有较好的抗辐射作用^[4,11]，这与本次观察的纳米氧化铈的结果相类似，这可能与稀土化合物的特性有关，其具体机制尚有待进一步研究。