宇宙射线中高能重离子（C、O、Mg、Fe、Si等）丰度虽然只有1%，但是其对剂量和等效剂量的贡献非常明显^[1]。与低LET射线相比，重离子剂量分布曲线有Bragg峰，且在输运过程中产生能量和方向都接近于原初粒子的次级碎片，碎片在原初粒子径迹周围沉积能量,使得重离子的径迹与γ射线的径迹结构产生很大差别,并导致较强的相对生物效应（RBE）^[2]。基因是细胞生命活动的控制调节中心，基因表达改变是细胞对环境刺激的重要生化分子反应。电离辐射可以改变多个信号传导通路，其中，许多基因和分子信号参与了DNA的损伤和修复。不同功能基因的改变将产生不同的生物学后果。本研究利用基因芯片技术，初步探讨⁵⁶Fe¹⁷⁺及¹²C⁶⁺两种不同传能线密度重离子照射后人淋巴细胞基因表达转录谱的改变，通过对两种不同LET重离子束照射后基因转录谱的比较，进而寻找重离子辐射敏感基因，为重离子辐射损伤标志物及重离子辐射损伤机制的研究提供实验数据。

1. 细胞系、主要试剂及仪器：人淋巴细胞系PengEBV购于中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库。荧光标记试剂盒、基因表达洗涤试剂盒及基因表达杂交试剂盒、8×60 K基因芯片（美国Agilent公司）；TRIzol（RNA抽提试剂）（美国Sigma公司）；RNA纯化试剂盒（德国Qiagen公司）。NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）；PCR仪（美国ABI公司）。

2. 辐射源：⁵⁶Fe¹⁷⁺离子束（中国科学院近代物理研究所），能量165 MeV/Nu，LET约400 keV/μm，吸收剂量率为0.2～0.5 Gy/min。¹²C⁶⁺离子束（中国科学院近代物理研究所），能量165 MeV/Nu，LET=26 keV/μm，吸收剂量率为0.3～0.5 Gy/min。

3. 细胞培养与照射：在含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基（美国GIBCO公司）中，于37℃、5％CO₂条件下培养淋巴细胞PengEBV。取对数生长期的淋巴细胞，调整细胞浓度为1×10 ⁶/ml，设0.1、0.5、2.0 Gy 3个剂量点，分别利用重离子⁵⁶Fe¹⁷⁺及¹²C⁶⁺束流进行照射，悬浮细胞垂直置于重离子束的坪区。以未照射组为对照组。

4. 淋巴细胞总RNA的分离提取及纯化：淋巴细胞PengEBV经⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺离子束照射后培养至24 h，1 500 r/min，离心半径76 cm，离心10 min，收集细胞沉淀，利用TRIzol试剂提取各剂量组人淋巴细胞总RNA，并利用QIAGEN RNeasy^®Kit对RNA进行纯化。

5. cDNA与cRNA的合成：cDNA与cRNA的合成采用荧光标记试剂盒完成。取0.2 μg RNA于0.2 ml离心管中，加入2 μl阳性内参混合液（Spike Mix）及0.8 μl T7启动子引物（T7 Promoter Primer），65℃ 10 min，冰浴5 min以合成cDNA第1链；然后，加入7 μl cDNA第2链反应液（Master Mix）后进行PCR扩增获得双链DNA，PCR反应条件为40℃ 2 h；70℃ 15 min。最后，在上述体系中加入6 μl反转录反应液，40℃孵育2 h，合成荧光标记cRNA并纯化。

6. 基因芯片杂交：基因芯片杂交采用基因表达杂交试剂盒完成。取165 μg纯化后的cRNA于55 μl cRNA反应体系中，60℃ 30 min进行片段化，加入55 μl杂交反应试剂（美国GE公司Hyb）。随后，将含有cRNA样本的混合液加入到芯片中，65℃ 10 r/min滚动杂交17 h。

7. 芯片扫描及数据分析：将洗涤后的基因芯片于Agilent扫描仪中扫描，分辨率为5 μm，扫描仪自动以100%和10%光电倍增信号强度（PMT）各扫描1次，Agilent软件对两次扫描结果自动合并。采用Feature Extraction10.7.1.1软件（美国Agilent Technologies公司）处理原始图像提取原始数据。利用Genespring125软件（美国Agilent Technologies公司）进行quantile标准化和后续处理。标准化后的数据进行过滤，在用于比较的每组样本中至少有1组100%标记为Detected的探针留下进行后续分析。利用倍数变化值进行差异基因筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥20。

8. 差异基因的GO及通路分析：对差异基因进行GO分析，统计每个GO条目中所包含的差异基因个数，并用统计检验的方法计算每个GO条目中差异基因富集的显著性。同时结合KEGG数据库，对差异基因进行通路显著性分析，分析每个通路中所包含的差异基因个数，用统计检验计算每个通路中差异基因富集的显著性。显著性分析将获得富集显著性P值，P值表明差异基因在GO条目或通路中的富集程度，P<0.05为富集显著。

1. 基因芯片分析结果：经0.1、0.5、2 Gy重离子束照射的人淋巴细胞PengEBV基因转录谱发生了明显改变。其中，0.1 Gy剂量组，⁵⁶Fe¹⁷⁺重离子照射筛选获得差异表达基因2 0.83个，上调表达1 0.82个，下调表达1 00.1个；¹²C⁶⁺重离子照射筛选获得差异表达基因1 966个，上调表达1 113个，下调表达853个；两种重离子束共同差异表达基因10.1个，其中，56个基因表达趋势一致，上调37个，下调19个。05 Gy剂量组，⁵⁶Fe¹⁷⁺照射组差异表达基因4 390个，上调表达2 899个，下调表达1 491个；¹²C⁶⁺照射组差异表达基因2 315个，上调1 095个，下调1 220个；两种重离子束共同差异表达基因199个，其中76个基因表达趋势一致，上调42个，下调34个。2 Gy剂量组，⁵⁶Fe¹⁷⁺照射组差异表达基因3 924个，上调2 525个，下调1 399个；¹²C⁶⁺照射组差异表达基因2 411个，上调1 055个，下调1 356个；两种重离子束共同差异表达基因229个，其中，110个基因表达趋势一致，上调76个，下调34个。3个剂量组两种离子束共同诱发差异表达基因14个，其中7个基因表达趋势一致，分别为GPSM1、ADAMTS6、WFDC2、LAD1、ADAMTS6、TSPYL5、MYADML2。对7个基因差异表达情况进行分析，结果显示，⁵⁶Fe¹⁷⁺重离子束照射各剂量组GPSM1、ADAMTS6、WFDC2、LAD1 4个基因差异表达倍数均明显高于¹²C⁶⁺重离照射组，且GPSM1、WFDC2、LAD1均呈现较好的剂量相关性。表 1列出两种离子束照射后3个剂量组共同差异表达基因。

表 1(Table 1)

表 1 56Fe17+、12C6+两种重离子束对人淋巴细胞系PengEBV照射后3个剂量组共同差异表达基因 Table 1 The common differential expression genes in the human lymphoblastoid cells PengEBV irradiated by 6Fe17+and 12C6+ions of 3 different doses 基因登录号 基因名称 基因定义 差异倍数a 56Fe17+离子束 12C6+离子束 0.1 Gy 0.5 Gy 2 Gy 0.1 Gy 0.5 Gy 2 Gy NM_0.15597 GPSM1 Homo sapiens Gprotein signaling modulator 1,transcript variant 2 -9.05 -8.23 -7.87 -2.8 -2.39 -3.12 NM_197941 ADAMTS6 Homo sapiens ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif,6 -3.68 -21.45 -15.15 -2.82 -2.12 -246 NM_00.1145113 MYADML2 Homo sapiens myeloidassociated differentiation markerlike 2 -3.17 -3.88 -2.62 -3.53 -2.96 -3.14 NM_033512 TSPYL5 Homo sapiens TSPYlike 5 -2.65 -4.53 -2.0.1 -3.81 -4.03 -3.98 NM_00.6103 WFDC2 Homo sapiens WAP fourdisulfide core domain 2 2.92 3.7 4.0.8 2.45 2.89 3.42 NM_005558 LAD1 Homo sapiens ladinin 1 5.13 11.78 12.79 2.0.6 2.42 2.0.6 NM_0.21603 FXYD2 Homo sapiens FXYD domain containing ion transport regulator 2,transcript variant b 5.35 6.37 5.78 2.03 2.15 2.25 NM_00.114520.6 KIAA1671 Homo sapiens KIAA1671 2.19 -2.28 12.14 -3.54 -8.52 -3.77 NM_00.1113434 C17orf51 Homo sapiens chromosome 17 open reading frame 51 2.36 -2.25 -2.2 3.16 11.51 349 NM_0.20.639 RIPK4 Homo sapiens receptorinteracting serinethreonine kinase 4 3.13 2.94 2.67 -2.0.1 2.34 -2.96 NM_00.1099 ACPP Homo sapiens acid phosphatase,prostate ,transcript variant 1 3.45 3.76 2.38 -14.79 -21.95 -22.18 NM_17350.8 SLC35F3 Homo sapiens solute carrier family 35,member F3 4.91 3.92 2.34 -3.61 -5.0.2 -4.97 注:a与未照射组相比

表 1 56Fe17+、12C6+两种重离子束对人淋巴细胞系PengEBV照射后3个剂量组共同差异表达基因 Table 1 The common differential expression genes in the human lymphoblastoid cells PengEBV irradiated by 6Fe17+and 12C6+ions of 3 different doses

2. 差异基因的GO分析：对⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺两种重离子束照射后3个剂量组差异表达基因进行GO分析，结果表明，0.1 Gy剂量组两种离子束诱发共同差异表达基因主要功能包括细胞粘连、胞外基质构建、耳蜗发育、心肌细胞发育、细胞表面受体信号通路等；05 Gy剂量组主要基因功能包括细胞粘连、胞外基质构建、神经系统发育、突触传递、轴突始段膜去极化的调控、离子跨膜运输调节、Sertoli细胞发育等；2 Gy剂量组主要基因功能包括细胞粘连、Rho蛋白信号转导调节、蛋白激酶B活性激活、胞外基质构建、Notch信号通路、上皮细胞增殖正向调节、GTP酶活性正向调节、视网膜发育、cAMP应答、基因沉默调控等。

3. 差异基因的通路分析：结合KEGG数据库，对差异基因进行通路显著性分析。结果表明，0.1 Gy剂量组，⁵⁶Fe¹⁷⁺重离子照射诱发显著性通路33个，¹²C⁶⁺重离子照射诱发通路13个，两种重离子共同显著性通路3条，分别为细胞因子受体相互作用通路（cytokinecytokine receptor interaction）、 青少年发育期糖尿病（maturity onset diabetes of the young）、谷氨酸能神经元突触（glutamatergic synapse）。05 Gy剂量组，⁵⁶Fe¹⁷⁺照射诱发通路25个，¹²C⁶⁺照射诱发通路17个，共同显著性通路6条，分别为细胞因子受体相互作用通路、尼古丁成瘾性通路（nicotine addiction）、cAMP信号通路、癌症中的转录错误调控通路（transcriptional misregulation in cancer）、阿米巴病、退伍军人症（legionellosis）。2 Gy剂量组，⁵⁶Fe¹⁷⁺照射诱发通路8个，¹²C⁶⁺照射诱发通路11个，共同显著性通路3条，为癌症中的转录错误调控通路、p53信号通路和系统性红斑狼疮。表 2为⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺两种重离子束诱发差异表达基因共同涉及的通路，从中可见，同一个通路中，⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺两种重离子照射激活的基因数量不同，⁵⁶Fe¹⁷⁺较¹²C⁶⁺可诱发更多的基因参与同一通路。

表 2(Table 2)

表 2 56Fe17+、12C6+两种重离子束诱发差异表达基因共同涉及的通路 Table 2 The common gene pathways induced by 56Fe17+and 12C6+ions 组别 通路名称 56Fe17+离子束 12C6+离子束 基因数 P值a 基因数 P值a 0.1 Gy剂量组 Cytokine-cytokine receptor interaction 32 <0.001 18 0.018 Maturity onset diabetes of the young 5 0.018 5 0.005 Glutamatergic synapse 12 0.025 10 0.018 0.5 Gy剂量组 Cytokinecytokine receptor interaction 41 0.006 23 0.015 Nicotine addiction 10 0.012 7 0.076 cAMP signaling pathway 31 0.016 19 0.011 Transcriptional misregulation in cancer 28 0.019 16 0.031 Amoebiasis 19 0.02 11 0.034 Legionellosis 11 0.033 7 0.032 2 Gy剂量组 Transcriptional misregulation in cancer 31 0.001 17 0.02 p53 signaling pathway 12 0.03 10 0.005 Systemic lupus erythematosus 21 0.016 23 <0.001

表 2 56Fe17+、12C6+两种重离子束诱发差异表达基因共同涉及的通路 Table 2 The common gene pathways induced by 56Fe17+and 12C6+ions

p53信号通路在辐射损伤中具有阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和促进DNA修复等作用。对p53信号通路基因在⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺重离子照射后的表达情况进行分析，结果显示，两种重离子照射诱发的p53信号通路基因并不一致。表 3列出了⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺重离子束诱发p53信号通路中参与基因情况。

表 3(Table 3)

表 3 重离子束诱发p53信号通路中参与基因情况 Table 3 The genes of p53 signal pathway induced by 56Fe17+ and 12C6+ions 离子束 基因 56Fe17+ GADD45G、ZMAT3、SESN1、CDKN1A、MDM2、GADD45A、THBS1、PERP、IGFBP3、TP53I3、RRM2B、SHISA5 12C6+ CCNG2、SESN1、BAX、CDKN1A、RRM2B、TP53、CASP8、ATR、MDM4、CASP3

表 3 重离子束诱发p53信号通路中参与基因情况 Table 3 The genes of p53 signal pathway induced by 56Fe17+ and 12C6+ions

宇宙辐射与地面辐射有很大不同，空间辐射在生物学上最有意义的是高能量的重离子。Setlow^[3]的研究表明，在采取屏蔽措施情况下，3年的深空间飞行中每个细胞核仍会受到400个质子、0.6个碳离子、003个铁离子的轰击，即生物体3%的细胞会受到高损伤铁离子的轰击。此外，地面加速器的模拟实验证实，航天员眼前有时发生的闪光现象是高能重离子射线辐照在视网膜上产生的效应^[2]。因此，高能重离子的生物损伤效应是空间辐射生物学最关心问题。本研究利用重离子加速器产生的⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺两种不同LET重离子束，研究探讨重离子束照射对人淋巴细胞基因转录谱影响，进而筛选重离子辐射敏感差异表达基因。根据文献报道，宇航员短期飞行所受最大剂量约为0.18 Sv，1次太阳粒子事件对宇航员的剂量贡献约为05 Sv，临床肿瘤治疗1次照射剂量为2.0 Gy，为此本研究将实验组设为0.1、0.5、2.0 Gy 3个剂量组。3个剂量组淋巴细胞经基因芯片检测结果表明，⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺重离子束流均能诱发人淋巴细胞基因转录谱的改变，比对分析显示，GPSM1、ADAMTS6、TSPYL5、WFDC2、LAD1、FXYD2、MYADML2 7个基因在⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺两种重离子束照射后特征性差异表达。其中，GPSM1、ADAMTS6、TSPYL5下调表达，WFDC2、LAD1、FXYD2上调表达，且WFDC2在两种重离子束照射后均呈现较好的剂量相关性，基因表达量随照射剂量的升高而升高。此外，GPSM1、LAD1基因在⁵⁶Fe¹⁷⁺重离子照射后呈现较好的剂量相关性，GPSM1基因表达随照射剂量增加下调程度降低，LAD1基因表达量随照射剂量升高而升高。

有研究报道，GPSM1、TSPYL5、LAD1基因功能与损伤修复相关。GPSM1是一种G蛋白信号转导调节蛋白，其可通过强化cAMP响应因子结合蛋白CREB的磷酸化作用在急性脑损伤和多发性骨髓癌中起抗凋亡作用^[4-5]。本研究发现，基因CREB5、CREB3L1在⁵⁶Fe¹⁷⁺照射后各剂量组呈现不同程度差异表达，推测GPSM1可能与CREB5、CREB3L1相互作用进而参与重离子辐射损伤修复中的凋亡调控。TSPYL5 基因属于TSPYL 家族，其蛋白产物在维持细胞活力及细胞形态和神经系统稳定上发挥着极为重要的作用^[13]。在A549肺腺癌细胞中，TSPYL5的抑制表达可增强细胞对γ射线的辐射敏感性，并上调p21(WAF1/Cip1) 表达导致细胞生长阻滞^[6]。本研究结果显示，TSPYL5在各剂量组均呈现下调表达，且2 Gy剂量组两种离子束照射后淋巴细胞p21基因均呈现上调表达，推测TSPYL5可能通过与p21相互作用参与了重离子辐射损伤的调控。层粘连蛋白LAD1作为细胞外基质的主要成分，可降低内皮细胞辐射损伤^[7-8]。本研究中LAD1在各剂量组上调表达，且基因表达呈现较好的剂量相关性，揭示其抗重离子辐射损伤的作用。

此外，重离子照射可诱发细胞致瘤性转化^[9-10]。本研究获得的差异表达基因WFDC2、TSPYL5均与癌症的发生发展密切相关。WFDC2又称人附睾蛋白4(HE4)，是蛋白酶抑制剂家族成员，具有免疫调节作用及抑制细胞增殖的作用，近年来作为新型肿瘤标志物已应用于临床^[11]。TSPYL5在许多肿瘤中都出现表达的缺失或者下调，被认为是一种新的抑癌基因^[12-14]。WFDC2、TSPYL5能否作为重离子致癌性转化的标志物及其在重离子辐射损伤进程中扮演何种角色，还需进一步实验研究。

辐射损伤是一个多点控制、多基因共同作用的结果。参与调控的众多基因不是孤立的个体，而是彼此构成相互作用的网络通路。对差异表达基因进行通路分析，结果显示，随照射剂量的增加，各剂量组差异表达基因参与的通路亦不同。其中，低剂量照射组通路以炎性反应相关调节通路为主，高剂量组呈现癌症调节、红斑狼疮、p53信号通路的富集，显示不同剂量组照射细胞损伤修复程度的不同。此外，两种离子束照射后，同一通路中参与基因个数及种类也有所差别。p53信号通路具有阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和促进DNA修复作用，从而避免受损DNA堆积，维持遗传的稳定性和防止细胞的转化。⁵⁶Fe¹⁷⁺、¹²C⁶⁺重离子束均可诱发p53信号通路，但调控基因确有很大差异。其中，对于通路中细胞周期调控，⁵⁶Fe¹⁷⁺照射诱发基因为MDM2、CDKN1A、GADD45，而¹²C⁶⁺重离子照射诱发基因为ATR、p53、CDKN1A；对于通路中的细胞凋亡调控，⁵⁶Fe¹⁷⁺诱发基因为TP53I3、SHISA5、PERP、ZMAT3、IGFBP3，而¹²C⁶⁺诱发基因为CASP8、BAX、CASP3；对于DNA损伤修复调控，⁵⁶Fe¹⁷⁺诱发基因为RRM2B、GADD45、SESN1，而¹²C⁶⁺诱发基因为SESN1、RRM2B。上述差异揭示两种重离子束激活Pathway通路的途径及调控方式的不同。

总之，本研究通过基因芯片技术证实重离子束可诱导人淋巴细胞基因转录谱的改变，初步筛选得到GPSM1、TSPYL5、LAD1、WFDC2等差异表达基因，这些基因可能在重离子辐射损伤中发挥作用，但其具体作用机制尚需进一步研究证实。