氮氧自由基化合物对<sup>60</sup>Co γ射线致BALB/c小鼠辐射损伤的防护作用

引用本文

林艳云, 王峰, 王海波, 蒋大鹏, 高鹏, 任正华, 吴涛, 郎海洋, 曾丽华, 郭国祯, 丁桂荣氮氧自由基化合物对⁶⁰Co γ射线致BALB/c小鼠辐射损伤的防护作用[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2016, 38(6): 401-405, DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2016.06.001. 复制到剪切板

氮氧自由基化合物对⁶⁰Co γ射线致BALB/c小鼠辐射损伤的防护作用

林艳云, 王峰, 王海波, 蒋大鹏, 高鹏, 任正华, 吴涛, 郎海洋, 曾丽华, 郭国祯, 丁桂荣

710032 西安，第四军医大学军事预防医学系放射医学教研室（林艳云、蒋大鹏、高鹏、任正华、吴涛、郎海洋、曾丽华、郭国祯）,化学教研室（王海波）,辐射生物学教研室（丁桂荣）;030006 太原，武警山西总队医院CT 室（王峰）

收稿日期: 2015-11-09

基金项目: 国家科技支撑计划（2013BAK03B05）;国家973 计划（2011CB503704）;国家自然科学基金（81272490,31470828）;军队指令性项目（13BJYZ29）

通信作者: 丁桂荣. E-mail:dingzhao@fmmu.edu.cn.

[摘要] 目的观察氮氧自由基化合物NHCOCH3-TEMPO 对雄性BALB/ c 小鼠电离辐射损伤的防护效果。方法将120 只雄性BALB/ c 小鼠按随机数字表法分成4 和7 Gy 照射组，每组60 只，每组再按随机数字表法分成6 组，每组10 只，分别为生理盐水对照组、生理盐水照射组、低剂量 TEMPO 照射组、中剂量TEMPO 照射组、高剂量TEMPO 照射组和阳性对照（WR-2721）组。⁶⁰ Co γ 射线照射前0.5 h 动物腹腔注射防护药物，剂量分别为：WR-2721 组200 mg/ kg、低、中、高剂量TEMPO 组分别为100、200 和400 mg/ kg、生理盐水对照组和生理盐水照射组给予等量生理盐水。4 Gy 全身照射组用于观察小鼠照后8 和15 d 骨髓有核细胞数、骨髓DNA 含量和外周血象的变化；7 Gy 全身照射用于观察小鼠照后30 d 生存率。结果 4 Gy 照射后，TEMPO 预处理组小鼠骨髓有核细胞计数、骨髓DNA 含量较生理盐水照射组均明显增加（t =2.53 ～6.13,P ＜ 0.05）;中剂量TEMPO 预处理组小鼠外周血白细胞数较生理盐水照射组明显增加（t =4.34,P＜0.05）,但外周血红细胞数与生理盐水照射组相比，差异无统计学意义。7 Gy 照射后，低剂量TEMPO 预处理组小鼠30 d 存活率较生理盐水照射组明显增加（χ² =5.934,P＜0.05）. 结论氮氧自由基化合物NHCOCH3-TEMPO 对雄性 BALB/ c 小鼠γ 射线辐射损伤有一定的防护作用。

[关键词] BALB/ c 小鼠 γ 射线辐射防护

Radioprotective effects of nitroxide compound NHCOCH3-TEMPO in BALB / c mice

Lin Yanyun, Wang Feng, Wang haibo, Jiang Dapeng, Gao Peng, Ren Zhenghua, Wu Tao, Lang Haiyang, Zeng Lihua, Guo Guozhen, Ding Guirong

Department of Radiation Medicine（Lin YY, Jiang DP, Gao P, Ren ZH, Wu T, Lang HY, Zeng LH, Guo GZ）,Department of Chemistry （Wang HB）,Department of Radiation Biology （Ding GR）, Faculty of Preventive Medicine, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China;CT Department, Shanxi Province Corps Hospital, Chinese People′s Armed Police Forces, Taiyuan 030006, China （Wang F）

Corresponding author: Ding Guirong. E-mail:dingzhao@fmmu.edu.cn.

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of nitroxide compound NHCOCH3-TEMPO against γ-ray irradiation-induced injury in male BALB/c mice. Methods 120 BALB/c male mice were randomly divided into two super group, each super group then were randomly divided into 6 groups: control group, normal saline(NS)+ γ group, low-dose TEMPO+γ group, middle-dose TEMPO+γ group, high-dose TEMPO+γ group and the positive control (WR-2721)+γ group. BALB/c mice were intraperitoneally injected with nitroxide compound at 0.5 h before whole body ⁶⁰Co γ-ray irradiation. The drug dosages were as follows: WR-2721 group 200 mg/kg, low-dose TEMPO group 100 mg/kg, middle-dose TEMPO group 200 mg/kg, high-dose TEMPO group 400 mg/kg. The first super group of the mice was given 7 Gy γ-ray whole-body irradiation, and then 30 d survival rate was observed. The second super group of the mice was given 4 Gy γ-ray whole-body irradiation. The number of nucleated cells and the content of DNA in bone marrow, as well as the blood routine were detected. Results At 8^th and 15^th day after 4 Gy γ-ray irradiation, the number of bone marrow nucleated cells, the content of DNA significantly increased in TEMPO+γ-ray groups compared with NS+γ-ray group(t=2.53-6.13，P＜0.05). The number of white blood cells significantly increased in middle dose TEMPO+γ-ray groups compared with NS+γ-ray group(t=4.34，P＜0.05), while there was no significant difference in the number of red blood cells between the TEMPO+ γ-ray group and the NS+γ-ray group. After 7 Gy γ-ray irradiation, the survival rate of mice on the 30^th day significantly increased in low-dose TEMPO+γ-ray group compared with NS+γ-ray group(χ²=5.934，P＜0.05). Conclusion The nitroxide compound NHCOCH3-TEMPO could provide radio protective effects in BALB/c mice.

[Key words] Nitroxide compound BALB/c mice γ-rays Radiation protection

抗辐射药物又称辐射防护剂，是指在生物体电离辐射作用前或作用早期应用，能减轻电离辐射对全身或局部的损伤，并有助于损伤治疗和恢复的一类化合物的总称。近年来，随着核技术在能源、医疗、军事、食品加工等方面的广泛应用，特别是2011年日本福岛核电站核泄漏事故的发生，使得核安全再次引起人们的关注，也再一次掀起了抗辐射药物的研究热潮^[1]。目前认为抗辐射药物主要通过形成混合双硫化物、减少自由基的产生、降低机体氧分压和促进内源性防护剂释放等方式，保护机体，减少辐射损伤^[2]。如氨琉基类化合物，是研究历史较长且效果较好的一类辐射防护药物^[3-4]，主要通过形成混合双硫化物，清除自由基，进而促进损伤细胞的修复。其中，氨琉基类代表药物氨磷汀(WR-2721)，已获国家食品和药品管理局(FDA)上市批准，成为唯一应用在人体的辐射保护剂，具有良好的辐射防护作用^[5-6]，但是WR-2721的治疗指数较小，并且在低剂量时就有着较为明显的不良反应，如低血压、恶心、呕吐、过敏性皮疹、休克等。此外，WR-2721防护时间窗较窄及用药途径受限等缺点，也限制了其进一步开发和使用^[7]。因此，目前临床上仍然缺乏较为理想的抗辐射药物，开发具有高效低毒、防治兼备的辐射损伤防护药物显得尤为重要。鉴于电离辐射主要通过产生大量的自由基引起损伤效应，而氮氧自由基具有强大的自由基清除能力，可以通过“催化”的方式持续分解大剂量的O₂^-，具有其他自由基清除剂无法相比的效果^[8]，因此，成为国内外重点关注的新辐射防护药物^[9-10]。本研究选用新合成化合物氮氧自由基NHCOCH3-TEMPO，观察了其对BALB/c小鼠辐射损伤的防护作用，为开发新型辐射防护药物奠定基础。

材料与方法

1.主要试剂及仪器：氮氧自由基NHCOCH3-TEMPO由西安第四军医大学化学教研室合成提供，⁶⁰Co γ射线源由西安第四军医大学放射教研室提供，氨磷汀(WR-2721，美国Sigma公司)，动物血细胞分析仪(深圳普康电子有限公司)，电子天平(德国Sartorius公司)，蛋白核酸测定仪(美国Bio-Rad公司)。

2.动物分组：雄性BALB/c小鼠，SPF级，体重(20±2)g，由西安第四军医大学实验动物中心提供[合格证号：scxk(军)2007-007]。雄性BALB/c小鼠120只，按随机数字表法分为4和7 Gy照射组，每组60只。两部分小鼠均再按随机数字表法分为6组，每组10只，分别为：生理盐水对照组、生理盐水照射组、低、中、高剂量TEMPO组和WR-2721组。

3.药物配置和给药方法：NHCOCH3-TEMPO为橙色粉末，用生理盐水配制成浓度为25 mg/ml的溶液，WR-2721使用生理盐水配制成浓度为20 mg/ml的溶液。低、中、高剂量TEMPO组给药量分别为100、200和400 mg/kg、WR-2721组给药量为200 mg/kg、生理盐水对照组和生理盐水照射组给予等量生理盐水，于⁶⁰Co γ射线照射前0.5 h腹腔注射给药。

4.辐照方法：7 Gy照射组，⁶⁰Co γ射线全身照射，照射距离70 cm、剂量率107.46 cGy/min。4 Gy照射组，⁶⁰Co γ射线全身照射，照射距离80 cm、剂量率81.42 cGy/min。

5. 小鼠生存率的检测：小鼠接受7 Gy ⁶⁰Co γ射线全身照射后连续观察30 d，记录小鼠的生存状况和死亡情况。

6. 骨髓有核细胞计数的测定：4 Gy全身照射后8和15 d，各取5只小鼠，称重后颈椎脱臼处死，取左侧第二股骨。用1 ml细胞培养液将骨髓全部冲入抗凝管内，轻轻摇晃使细胞分散悬浮，制成单细胞悬液，使用全自动血细胞计数仪检测骨髓有核细胞计数。

7. 骨髓DNA含量的检测：4 Gy照射后8和15 d，各取5只小鼠，称重后颈椎脱臼处死，取右侧第二股骨。用1 ml的CaCl₂溶液将骨髓全部冲入离心管内；置于4℃冰箱内0.5 h后，再离心15 min，转速为2 500 r/min，离心半径10 cm，弃去上清液；向离心管内加入1 ml的HClO₄溶液，轻轻吹打使离心管内沉淀物悬浮；90℃加热15 min，冷却后用无灰滤纸过滤，放置在-20℃冰箱内固定；使用蛋白核酸测定仪，检测每个样本所提取的总DNA质量和浓度。

8. 外周血常规指标测定：4 Gy ⁶⁰Co γ射线全身照射后1、3、5、10和15 d，小鼠剪尾取血，并使用全自动血细胞计数仪检测外周血象。

9. 统计学处理：结果以x±s表示。使用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析。两组间比较采用t检验，存活率数据采用χ²检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1. NHCOCH3-TEMPO对辐照损伤小鼠生存率的影响： BALB/c小鼠受到7 Gy ⁶⁰Co γ射线全身照射后，生理盐水照射组小鼠表现为精神萎靡、行动迟缓、食欲下降，但药物处理组小鼠的上述体征均有所改善。生理盐水照射组小鼠在7 Gy照射后3 d开始出现死亡，到20 d共死亡8只，到照后30 d存活2只；低剂量TEMPO组小鼠照后12 d开始出现死亡，到22 d共死亡5只，到照后30 d存活5只；中剂量TEMPO组小鼠从照后8 d开始死亡，到13 d共死亡7只，到照后30 d存活3只；高剂量TEMPO组小鼠从照后7 d开始死亡，到15 d共死亡7只，到照后30 d存活3只。生理盐水对照组和WR-2721组小鼠未出现死亡现象。低剂量TEMPO预处理组小鼠30 d存活率较生理盐水照射组明显增加(χ²=5.934,P＜0.05)。

2. NHCOCH3-TEMPO对辐照损伤小鼠骨髓有核细胞计数的影响：4 Gy γ射线照射后，8和15 d小鼠骨髓有核细胞计数的变化情况列于表 1。由表 1可知，照后8和15 d，生理盐水照射组小鼠骨髓有核细胞计数明显低于生理盐水对照组，差异有统计学意义(t=9.84、4.69，P＜0.05)，照后8 d，低和高剂量TEMPO组小鼠骨髓有核细胞计数明显高于生理盐水照射组(t=3.66、2.60，P＜0.05)。照后15 d，高剂量TEMPO组和WR-2721组小鼠骨髓有核细胞计数明显高于生理盐水照射组(t=2.53、2.69，P＜0.05)。

表 1 Gy照射后不同时间各实验组小鼠骨髓有核细胞计数(×10⁹/L，x±s) Table 1 The number of BMC in mice bone-marrow at different time after irradiation to 4 Gy(×10⁹/L，x±s)

3. NHCOCH3-TEMPO对辐照损伤小鼠骨髓DNA含量的影响：结果见表 2。由表 2可知，照后8和15 d，生理盐水照射组小鼠骨髓DNA含量明显低于生理盐水对照组，差异有统计学意义(t=5.92、5.00，P＜0.05)，照后8 d，高剂量TEMPO组和WR-2721组小鼠骨髓DNA含量明显高于生理盐水照射组(t=3.13、4.06，P＜0.05)。照后15 d，低、中、高剂量TEMPO组和WR-2721组小鼠骨髓DNA含量均明显高于生理盐水照射组(t=3.31、3.04、2.96、6.13，P＜0.05)。

表 2 4 Gy照射后不同时间各实验组小鼠骨髓 DNA含量(μg/ml，x±s) Table 2 The content of DNA in mice bone-marrow at different time after irradiation to 4 Gy(μg/ml，x±s)

4. NHCOCH3-TEMPO对辐照损伤小鼠外周血象的影响：结果见表 3,4。由表 3可知，照后1、5、10和15 d，4 Gy生理盐水照射组小鼠外周血中白细胞数量均明显低于生理盐水对照组，差异有统计学意义(t=11.67、7.27、22.06、10.85，P＜0.05)。照后5、10和15 d，TEMPO组和WR-2721组小鼠外周血中白细胞最低水平均高于生理盐水照射组，且中剂量TEMPO组在照后15 d白细胞数量明显高于生理盐水照射组(t=4.34，P＜0.05)；WR-2721组在照后5、10和15 d白细胞数量均高于生理盐水照射组(t=8.06、4.20、9.26，P＜0.05)。由表 4可知，照后1、5、10和15 d，4 Gy γ射线生理盐水照射组小鼠外周血中红细胞数量均明显低于生理盐水对照组，差异有统计学意义(t=2.60、3.84、2.92、4.95，P＜0.05)。但TEMPO组和WR-2721组与生理盐水照射组相比，差异无统计学意义。

表 3 4 Gy照射后不同时间各组小鼠外周血白细胞计数(×10⁹/L， x±s) Table 3 The number of white blood cells in mice at different time after irradiation to 4 Gy (×10⁹/L, x±s)

表 4 4 Gy照射后不同时间各组小鼠外周血红细胞计数(×10¹²/L，x±s) Table 4 The number of red blood cells in mice at different time after irradiation to 4 Gy (×10¹²/L，x±s)

讨论

电离辐射主要通过直接作用和间接作用两种方式对机体造成损害。直接作用指电离辐射能量直接沉积在生物大分子上，进而造成细胞膜结构的破坏、酶类活性的降低、DNA单链或双链断裂等生物效应。间接作用指电离辐射首先作用于水，使水分子生成两个初级自由基OH^-和H⁺，进而通过一系列自由基链式反应对生物大分子造成破坏。人体80%由水分子组成，因此，认为电离辐射对生物体所致的损伤效应主要是由自由基引起的，有效地清除体内有害自由基也成为电离辐射防护的重要途径之一。氮氧自由基是由C、O、N、H 4种原子组成的一种含有自旋单电子的稳定自由基化合物，它可以通过“催化剂量”的方式，快速持续的分解超氧阴离子O₂^-，而自身不被消耗，可以循环使用。正是由于其独特的抗氧化特性，氮氧自由基成为近年来被广泛研究和应用的一种新型电离辐射防护药物^[11-13]，且研究发现一些氮氧自由基具有较好的辐射防护作用^[14-16]。

本实验选用NHCOCH3-TEMPO预处理BALB/c小鼠，研究了其对BALB/c小鼠的生存率和骨髓造血系统的影响，并评价了TEMPO的辐射防护效果。首先观察了NHCOCH3-TEMPO化合物对高剂量射线照射后BALB/c小鼠一般情况和生存率的影响，发现药物预处理组小鼠在照射后一般情况较生理盐水照射组明显改善，小鼠死亡时间较生理盐水照射组明显推迟，30 d存活率也显著提高。随后又观察了NHCOCH3-TEMPO化合物对低剂量射线照射所致BALB/c小鼠造血系统损伤的防护作用，结果显示，氮氧自由基处理组和WR-2721组小鼠骨髓有核细胞数和骨髓DNA含量均高于生理盐水照射组。对小鼠外周血象的检测结果显示，氮氧自由基处理组和WR-2721组小鼠外周血中白细胞数均高于生理盐水照射组，但红细胞计数水平与生理盐水照射组之间并没有明显差异。根据以上实验结果，得到以下结论，NHCOCH3-TEMPO能明显延长大剂量射线照射后小鼠的生存时间，提高其存活率，并能减轻中等剂量射线对小鼠骨髓有核细胞的损伤，促进骨髓造血功能的恢复。虽然实验结果显示，WR-2721的辐射防护效果优于NHCOCH3-TEMPO，但由于后者较WR-2721具有毒性低的优势，将在后续研究中优化NHCOCH3-TEMPO的结构，提高其防护效果。此外，关于NHCOCH3-TEMPO的作用机制，也有待进一步研究。

利益冲突 无
作者贡献声明 林艳云负责实验操作、数据统计分析、论文撰写及修改；王峰参与实验操作；王海波设计和合成实验所用氮氧自由基化合物TEMPO；蒋大鹏、高鹏、任正华、吴涛、郎海洋、曾丽华共同参与实验操作，特别是在动物取材方面给予很大帮助；郭国祯、丁桂荣负责总体实验设计和论文撰写指导

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中华放射医学与防护杂志 2016, Vol. 38 Issue (6): 401-405	PDF