癌干细胞(cancer stem cell，CSC)，又称癌干细胞样细胞，具有干细胞性质的癌细胞，具有很强的自我复制和多细胞分化潜能等能力^[1]。常见的癌干细胞表面标志物有：CD133、CD44、CD24、CD90、CD166等^[2]，CD133和CD44普遍被认为是结肠癌干细胞标志物，本实验室的检测结果显示，p53野生型的HCT116细胞群中CD133和CD44双阳性细胞比例很高。鉴于癌干细胞的耐辐射和抗化疗的能力^{[3, 4]}，发展杀死癌干细胞的有效措施被认为是癌症治疗的新策略。

DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein-kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是放射所致DNA双链断裂损伤的非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)修复通路中关键分子^[5]。DNA-PKcs一方面通过维持基因组稳定性，显示防止细胞癌变的抑癌基因功能，另一方面因其具有DNA双链断裂修复功能，而且在很多肿瘤细胞中DNA-PKcs表现为高表达，由此导致肿瘤细胞的耐辐射和耐化疗能力增加。研究报道，包括NU7026在内的DNA-PKcs抑制剂或shRNA靶向抑制DNA-PKcs表达，能显著提高癌细胞的放射敏感性^{[6, 7, 8]}，显示其癌症治疗放射增敏的应用价值。鉴于癌干细胞的耐辐射能力，与肿瘤治疗疗效不佳有密切联系，本研究选择DNA-PKcs激酶活性特异抑制NU7026，探究抑制DNA-PKcs活性对含有高比例癌干细胞亚群的结肠癌细胞HCT116的放射增敏作用。

1. 试剂及药物配制：DNA-PKcs激酶抑制剂NU7026(美国Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)进口分装，Annexin V细胞凋亡试剂盒(日本DoJinDO公司)，0.25%的胰酶(美国Sigma公司)，缓冲液由本实验室配置(PBS，pH 7.2，含0.5%BSA，2 mmol/L EDTA)。荧光标记抗体：CD133/2(293C3)-FITC(德国Miltenyl Biotec公司)，CD44-PE(德国Miltenyl Biotec公司)；培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；γ-H2AX(ser139，德国Merck Millipore公司)；FITC标记二抗羊抗鼠IgG(北京中杉金桥公司)；DAPI(日本合光纯药株式会社)。采用DMSO溶解NU7026，规格为5 mg的NU7026中加入2 ml的DMSO，充分溶解后，再用McCoy′s 5A培养基稀释至所需浓度，DMSO终浓度低于<0.2%，对照组加入等体积的DMSO。

2. 细胞培养：用McCoy′s 5A培养基培养p53阳性的人结肠癌细胞系HCT116细胞由本实验室保存，培养基中添加10%胎牛血清，100 μg/ml青霉素以及80 μg/ml链霉素，在37℃，5%CO₂环境下孵育培养。用0.25%胰蛋白酶消化分离，进行传代。

3. 细胞照射：采用军事医学科学院辐射中心⁶⁰Co γ辐射源，吸收剂量率为133.25 cGy/min，室温照射，源靶距为3 m。

4. 细胞集落形成实验：取对数期细胞用于实验，接种于60 mm直径培养皿中。分为对照组(500个细胞)、单纯药物组(20 μmol/L NU7026，1 000个细胞)、单纯照射组(2 Gy，1 000个细胞)和药物+照射组(2 Gy+20 μmol/L NU7026，1 000个细胞)，每个点重复3个培养皿。5 ml培养液/皿，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养10～14 d。计算每组细胞集落形成率和细胞存活率，细胞集落形成率(%)=>50个细胞的克隆数/预先接种的细胞数×100%，细胞存活率(%)=实验组集落形成率/对照组集落形成率×100%。

5. 癌干细胞标志物检测：各处理组细胞经蛋白胰酶消化后，用冷却的PBS清洗，收集上清，用配制的缓冲液重悬细胞，再加入10 μl的荧光抗体CD133，避光4℃孵育10 min后，加入1～2 ml缓冲液1 200 r/min离心10 min，离心半径7 cm,去上清，加入200 μl的缓冲液重悬细胞，使其成为单个细胞，上流式细胞仪检测(或者加入200 μl的1%多聚甲醛重悬4℃保存，以待上流式细胞仪检测)。

6. 细胞周期检测：照射后24 h收集细胞，弃原液，用PBS洗3遍，用预先保存在-20℃的70%乙醇，4℃过夜固定，第2天取出，4℃1 500 r/min离心8 min，离心半径7 cm,用PBS离心洗两遍后，弃上清，加入100 μl PBS重悬细胞，加入RNase 2.5 μg至终浓度为50 μg/ml，37℃孵育30 min后，再加入200 μl PI混合均匀，上机检测。

7. 细胞凋亡检测：检测细胞照射后48 h的凋亡情况。收集细胞，用PBS洗2遍，再用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，取细胞悬液转移至离心管中，4 ℃ 5 000 r/min离心3 min，离心半径7 cm,弃上清，加入1 ml PBS离心3 min弃上清，加入100 μl 1×Annexin V结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexing V FITC结合物，再加入5 μl PI溶液。室温避光培养15 min，加入400 μl 1×Annexin V结合缓冲液，流式细胞仪检测。

8. 免疫荧光激光共聚焦检测γ-H2AX焦点(foci)：照射前1 d，每孔接种1×10⁶细胞，同时平行两组培养板细胞，一组只照射，另一组加药同时照射，2 Gy照射前2 h加入终浓度为20 μmol/L的NU7026，分别在照射后0、0.5、2、4、8、24 h时取出一片盖玻片，用4%的多聚甲醛固定细胞放入4℃保存，用预冷的PBS洗3次，用3%BSA室温孵育1 h后，0.25%Tritoon 100 破膜15 min后，取20 μl按1%BSA∶γ-H2AX为1∶200比例的鼠抗体γ-H2AX，4℃过夜后，用1%BSA洗3次；用1∶500稀释的FITC标记二抗羊抗鼠IgG室温避光孵育1 h，用1%BSA洗3次；再用 PBS∶DAPI(原液)为1∶1 000的DAPI稀释液，染核15 min，用PBS洗3次每次10 min，最后用50%的甘油封片，放湿盒，4℃避光，最后上激光共聚焦免疫荧光仪器检测。数据处理，每组每个时间点计数50个细胞的总焦点，计算每个细胞平均焦点数代表DNA损伤情况。

9．统计学处理：计量资料采用x±s 表示，所有实验独立重复至少3次。采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，对实验数据采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1. HCT116细胞癌干细胞标志物检测：本研究采用的细胞为p53野生型的HCT116细胞系，通过流式细胞仪检测CD133+/CD44+亚群细胞比例，结果显示，CD133+/CD44+双阳性细胞亚群的比例高达(88.14±0.47)%，为癌干细胞亚群优势细胞系。在体外无血清培养基中培养，集落形成率达到(84.75±1.35)%，显示HCT116细胞具有很强的集落形成能力。

2. NU7026对HCT116细胞受照射后增殖的影响：前期实验显示，NU7026在20 μmol/L浓度下对DNA-PKcs激酶活性具有抑制作用^[9]，本研究以此为药物作用浓度。NU7026和照射处理HCT116细胞的集落形成率和存活率结果列于表 1。单纯药物和单纯照射对HCT116细胞的增殖均具有抑制作用。药物+照射联合组的集落形成率和细胞存活率比单纯照射组下降更明显，差异有统计学意义(t=7.21、7.22，P<0.01)。

表1(Table 1)

表1 NU7026和照射处理HCT116细胞的集落形成率和存活率Table 1 The colony-formation rate and survival of HCT116 cells treated with or without NU7026 before 2 Gy irradiation (x±s ) 组别 样本数 细胞 克隆数 集落形成率 (%) 细胞存活率 (%) 注：“—”指无数据。与同一指标单纯照射组比较，a t=7.21， P <0.01；b t=7.22， P<0.01 对照组 3 448±27.85 89.67±3.57 — 单纯药物组 3 266±33.17 26.62±8.63 29.67±9.62 单纯照射组 3 377±19.23 35.72±1.40 39.84±1.56 药物+照射组 3 157±14.23 16.88±4.30a 18.81±4.80b

表1 NU7026和照射处理HCT116细胞的集落形成率和存活率 Table 1 The colony-formation rate and survival of HCT116 cells treated with or without NU7026 before 2 Gy irradiation

3. NU7026对HCT116细胞受照射后CD133阳性细胞亚群分布的影响：如表 2所示，HCT116细胞受2 Gy照射后，干细胞表面标志物CD133阳性细胞亚群的比例逐渐上升，显示HCT116癌干细胞的放射抗性。联合20 μmol/L NU7026处理，显著抑制了单独照射导致癌干细胞亚群的增加，从CD133阳性细胞亚群比例的下降表明NU7026增强了放射对癌干细胞的杀伤效应。

表2(Table 2)

表2 NU7026和2 Gy照射处理后不同时间对HCT116细胞CD133+癌干细胞亚群分布Table 2 The effects of NU7026 and/or 2 Gy irradiation on the distribution of CD133+ positive sub-population of HCT 116 cells (x±s ) 组别 样本数 0 h 24 h 48 h 注：a与单纯照射组比较， t=9.55， P<</i>0.01 单纯照射组 3 85.12±0.36 87.21±2.26 90.12±0.68 药物+照射组 3 84.33±0.33 77.98±3.09 74.23±2.80a

表2 NU7026和2 Gy照射处理后不同时间对HCT116细胞CD133+癌干细胞亚群分布 Table 2 The effects of NU7026 and/or 2 Gy irradiation on the distribution of CD133+ positive sub-population of HCT 116 cells

4. NU7026对照射诱发HCT116细胞G₂/M期阻滞的影响：HCT116细胞各处理组在照射后24 h的细胞周期分布的流式细胞分析如图 1所示。检测发现照射后24 h G₂/M期细胞比例仍然高于未经处理的对照组，而此时，药物+照射组的G₂/M阻滞率(39.62%±3.18%)显著高于单纯照射组(25.00%±0.89%)(t=7.67，P<0.01)。

图1(Figure 1)

图1 HCT116细胞各处理组在照射后24 h的细胞周期分布的流式细胞分析 A.对照组；B.单纯药物组；C.单纯照射组；D.药物+照射组 Figure 1 Cell cycle distribution of the HCT116 cells after different treatments, and it was detected by flow cytometry analysis at 24 h after irradiation A. Control; B. NU7026 alone; C. 2 Gy alone; D. NU7026+2 Gy

5. NU7026对照射诱发HCT116细胞凋亡的影响：HCT116各处理组细胞在2 Gy照射后48 h细胞凋亡的流式细胞分析结果如图 2所示。NU7026+2 Gy照射组细胞在照后48 h早期凋亡率为(40.10%±4.88%)，明显高于单独2 Gy照射组(15.92%±1.48%)(t=8.24，P<0.01)。

图2(Figure 2)

图2 HCT116各处理组细胞在2 Gy照射后48 h细胞凋亡的流式细胞分析 A.对照组；B.单纯药物组；C.单纯照射组；D.药物+照射组 Figure 2 Apoptosis induction in HCT116 cells，detected by flow cytometry analysis at 48 h after different treatments A. Control;B. NU7026 alone; C. 2 Gy alone; D. NU7026 and 2 Gy

6．NU7026对射线诱发HCT116细胞DNA双链断裂修复的影响：通过标志物γ-H2AX foci分析DNA双链断裂损伤修复情况。细胞受到辐射后0.5～24 h各时间点，药物+照射组细胞γ-H2AX foci数均显著高于单纯照射组(图 3，4)，NU7026表现出明显抑制DNA双链断裂修复的作用。

图3(Figure 3)

图3 2 Gy与2 Gy+NU7026两组细胞处理后2～24 h γ-H2AX焦点的免疫荧光检测图 Figure 3 The immunofluorescent staining images of γ-H2AX foci in the cells at 2-24 h after the treatments with 2 Gy alone or combined with 20 μmol/L NU7026

图4(Figure 4)

图4 2 Gy与2 Gy+NU7026两处理组细胞在γ射线照射后0.5～24 h的免疫荧光检γ-H2AX焦点数 注：a与同一时间单纯照射组比较，t=19.58、11.95、7.01、9.45，P<0.01 Figure 4 The kinetics of γ-H2AX foci formation in the HCT116 cells treated with 2 Gy alone or combined with 20 μmol/L NU7026 from 0.5h to 24 h after irradiation

本实验结果显示，HCT116细胞系中有高达88.14%的CD133/CD44双阳性细胞亚群，提示是一个癌干细胞处于优势细胞亚群的细胞系。DNA-PKcs是一个重要的DNA双链断裂修复蛋白，近年来，对其DNA修复功能以外的生物学作用，如细胞周期调控作用，受到关注，但都与细胞DNA损伤反应有关^{[10, 11]}。研究结果表明，在DNA-PKcs抑制剂NU7026的作用下，进一步降低了2 Gy照射HCT116细胞的存活率，显示出显著的放射增敏作用。更重要的是，HCT1160细胞单独2 Gy照射后，癌干细胞表面标志物CD133阳性细胞亚群所占比例增加，表明癌干细胞具有较高的放射抗性。DNA-PKcs抑制剂NU7026能显著抑制受照细胞的癌干细胞亚群的增加，显示出辐射对癌干细胞杀伤效应的增敏作用。

以往的研究表明，2 Gy中等剂量照射细胞发生G₂/M阻滞的高峰期是在受照后8～12 h，此后开始逐渐恢复。如果G₂/M阻滞后续响应机制异常，在照射后24 h仍然有较高的阻滞^{[10, 11, 12]}。在本研究中，HCT116细胞在2 Gy照射后24 h，药物+照射组的G₂/M期阻滞率显著高于单纯照射组，表明抑制DNA-PKcs导致放射诱发细胞G₂/M阻滞的恢复延迟或成为不可逆阻滞。前期研究表明，一旦G₂/M阻滞延长而转变为不可逆阻滞时，细胞就有可能是发生有丝分裂灾变死亡^[10]，这可能是NU7026放射增敏的机制之一。已知细胞要完成细胞质分裂，从有丝分裂期退出，其条件之一是Cyclin B1蛋白的降解。本课题组研究发现，DNA-PKcs缺陷导致Cyclin B1蛋白的泛素化蛋白酶体降解通路机制异常，从而导致Cyclin B1蛋白的堆积，细胞无法完成有丝分裂^[13]，由此可以解释本研究观察到的上述结果。此外，细胞凋亡检测结果，药物+照射组与单纯照射组在照射后24和72 h两个时间点的差异不明显，但在48 h，药物+照射联合处理组细胞的早期凋亡率，要显著高于单纯照射组，显然，NU7026增加了受照细胞的凋亡发生率。γ-H2AX foci免疫荧光结果显示，NU7026显著抑制细胞对放射诱发DNA双链断裂的修复能力，这与预想的结果一致。

本研究揭示，DNA-PKcs抑制剂NU7026对结肠癌细胞HCT116具有显著的放射增敏作用，特别是增加放射对癌干细胞的杀伤效应。NU7026除抑制细胞DNA修复功能外，还包括延迟细胞G₂/M期阻滞，乃至引发有丝分裂灾变、促进细胞凋亡发生。这种多途径放射增敏作用，非常有利于癌干细胞辐射抗性问题的解决，将为临床治疗癌症的放疗增敏剂的应用研究提供理论依据。