核与辐射事故发生后，快速有效地估算人员受照剂量，对于评估病情、指导治疗、判断预后具有十分重要的意义。本研究采用外周血淋巴细胞染色体“双着丝粒+环”畸变(dicentric chromosomes and rings,“dic+r”)分析、胞质分裂阻滞微核(cytokinesis-block micronucleus assay,CBMN) 分析、核质桥(nucleoplasmic bridges，NPB)+融合(fusion,F)+马蹄靴(horse shoe,H)+环(circular,C)(NPB +FHC)分析技术，并使用不同实验室的剂量-效应曲线，对南京“5.7”¹⁹²Ir源辐射事故患者“王”进行生物剂量估算，为临床救治提供剂量资料。

1. 受照者基本情况：2014年5月7日上午，南京“5.7”放射事故受照者在南京某厂工作时捡拾一枚链状金属物品(装有¹⁹²Ir源，事发时放射性活度为966.28 GBq，吸收剂量率0.8 Gy/min)，并放入其工作服右侧口袋内，站立时该源位于右大腿外侧，持续时间约为195 min，详见相关报道^{[1, 2]}。照后第5天患者入住本院后采集外周血，进行染色体“dic+r”分析、CBMN分析、NPB+FHC分析估算生物剂量。

2. 染色体和CBMN标本制备及分析

(1) 染色体标本制备及分析：采用培养开始加秋水仙素法，淋巴细胞混合培养液(广州拜迪生物医药有限公司)含RPMI 1640、胎牛血清、植物血凝素(PHA)、双抗、秋水仙素。秋水仙素终浓度为0.04 μg/ml。每瓶5 ml混合培养液加0.5 ml肝素锂抗凝血，37℃恒温箱培养48～50 h。使用HANABI PⅢ(美国Transgenomic公司)染色体(微核)收获系统制备细胞悬液，HANABI P0(美国Transgenomic公司)染色体分散仪滴片，姬姆萨染色。染色后，使用Metafer 4 (V 3.11.6)染色体扫描分析系统(德国MetaSystems公司) 进行全玻片自动中期分裂相寻找及全玻片高倍图像采集。对采集的高倍数字图像借助 Ikaros 染色体核型分析软件(德国MetaSystems公司)，选择染色体(46±1)条、长度适中、分散良好、很少重叠的中期分裂相，分析和记录“dic+r”畸变。

(2) CBMN标本制备及分析：每瓶5 ml淋巴细胞混合培养液(含RPMI 1640、胎牛血清、PHA、双抗)加0.5 ml肝素锂抗凝血，37℃恒温箱培养至44 h，加入Cyt-B(美国Sigma公司)，终浓度6 μg/ml，继续培养至72 h，使用HANABI PⅢ染色体(微核)收获系统制备细胞悬液，滴片后姬姆萨染色，×1 000倍镜检，记录双核细胞中的微核数。

(3) NPB +FHC分析：使用CBMN法制备的玻片标本，×1 000倍镜检，记录核质桥(NPB)及融合、马蹄形、环(FHC)细胞改变^{[3, 4]}。

3.生物剂量估算：使用CABAS 2.0软件进行剂量估算及染色体“dic+r”泊松分布u检验^[5]。选用文献公开报道或其他实验室提供的使用⁶⁰Co γ射线建立的7条剂量-效应曲线(表 1)。

表1(Table 1)

表1 南京“5.7”放射事故受照者生物剂量估算使用的剂量-效应曲线Table 1 Dose-effect curves applied to evaluate the biological doses at "5.7" accident in Nanjing 剂量效应曲线 吸收剂量率(Gy/min) 剂量范围(Gy) Y1("dic+r")=5.33 D2+7.56 D-3.36[6] 0.32 0.25～5.0 Y2("dic+r")=0.069 49 D2+0.034 98 D[7] 1.00 0.50～5.0 Y3("dic+r")=0.064 2 D2+0.022 3 Da 0.50 0.10～5.0 Y4("dic+r")=0.080 398 D2+ 0.034 037 D+0.007 351 2[8] 1.00 0.25～5.0 Y5(CBMN)=0.057 D2+0.019 D+0.017[9] 0.50 0.12～4.0 Y6(CBMN)=0.016 7 D2+0.093 1 Db 1.00 0～6.0 Y7(NPB+FHC)=0.000 02 D2+0.027 2 Db 1.00 0～6.0 注：a Y3剂量-效应曲线由中国辐射防护研究院段志凯博士提供;b Y6、 Y7剂量-效应曲线由中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所刘青杰博士提供。Y1.每百细胞“dic+r”数；Y2-Y4.每细胞“dic+r”数；Y5、Y6.每细胞微核数；Y7.每细胞“NPB+FHC”数；D.吸收剂量，Gy

表1 南京“5.7”放射事故受照者生物剂量估算使用的剂量-效应曲线 Table 1 Dose-effect curves applied to evaluate the biological doses at "5.7" accident in Nanjing

1. 染色体“dic+r”畸变分析及剂量估算：受照第5天，患者的染色体“dic+r”畸变为(0.18±0.01)/细胞。使用不同实验室、不同剂量率(0.32～1 Gy/min)染色体剂量-效应曲线估算的一次全身等效吸收剂量见表 2。不同剂量-效应曲线估算结果之间的差别＜16%，均与急性轻度骨髓型放射病的临床诊断相符合。

表2(Table 2)

表2 南京“5.7”事故受照者“dic+r”畸变分析结果及估算的全身等效剂量Table 2 The "dic+r" analysis and whole body equivalent dose at "5.7" accident in Nanjing 剂量曲线 分析细胞数 “dic+r”数 (“dic+r”)/细胞( p±Sp) 估算剂量(Gy) 均值 95% CI Y1 1 410 253 0.18±0.01 1.41 1.31～1.51 Y2 1 410 253 0.18±0.01 1.37 1.28～1.48 Y3 1 410 253 0.18±0.01 1.51 1.40～1.61 Y4 1 410 253 0.18±0.01 1.27 1.40～1.61 注：“dic+r”.“双着丝粒+环”畸变

表2 南京“5.7”事故受照者“dic+r”畸变分析结果及估算的全身等效剂量 Table 2 The "dic+r" analysis and whole body equivalent dose at "5.7" accident in Nanjing

将患者受照第5天的“dic+r”分布和剂量-效应曲线Y₃输入CABAS 2.0软件，进行不纯泊松分布法剂量估算。结果u=14.81>|1.96|，σ²/ y=1.56＞1.00，“dic+r”不符合泊松分布，为过离散分布，属于局部不均匀照射。分别有1 211、163、30、0、2、3、0、1个细胞出现0～7个“dic+r”。患者的身体受照份额为60%，平均剂量为2.62 Gy。

2.CBMN分析结果及估算剂量：患者受照第5天，两家实验室分别观察到的微核数/细胞、估算的剂量见表 3。两家实验室分别进行的CBMN分析剂量估算结果相近，均与急性轻度骨髓型放射病的临床诊断相符合。

表3(Table 3)

表3 南京“5.7”事故受照者CBMN分析结果及估算的受照剂量Table 3 Analysis of CBMN and dosage estimation at "5.7" accident in Nanjing 剂量曲线 分析细胞数 微核数 微核/细胞 (p±Sp) 估算剂量(Gy) 均值 95% CI Y5 1 316 223 0.17±0.010 1.47 1.36～1.60 Y6 3 000 492 0.16±0.007 1.41 1.30～1.51 注：CBMN.胞质分裂阻滞微核

表3 南京“5.7”事故受照者CBMN分析结果及估算的受照剂量 Table 3 Analysis of CBMN and dosage estimation at "5.7" accident in Nanjing

3.NPB+FHC分析结果及剂量估算：相关结果如图 1所示。患者受照第5天，NPB+FHC分析结果及估算的一次全身等效吸收剂量见表 4。根据NPB+FHC分析估算结果进行的临床分度与“dic+r”畸变分析及CBMN分析相同，符合急性轻度骨髓型放射病的临床诊断。

图1(Figure 1)

图1 南京“5.7”事故受照者的NPB+FHC细胞改变 A. 核质桥； B. 融合； C. 马蹄形； D. 环 Figure 1 Morphologies of NPB and FHC at “5.7” incident in Nanjing A. Nucleoplasmic bridges (NPB); B. Fusion (F); C. Horse shoe (H); D. Circular (C)

表4(Table 4)

表4 南京“5.7”事故受照者NPB +FHC分析结果及估算的受照剂量Table 4 Analysis of NPB+FHC and dose estimation at "5.7" accident in Nanjing 剂量曲线 分析细胞数 NPB+FHC NPB+FHC/细胞( p±Sp) 估算剂量(Gy) 均值 CI 95% Y7 2 000 71 0.035 5±0.004 2 1.30 1.00～1.60 注：NPB+FHC.核质桥+融合+马蹄靴+环

表4 南京“5.7”事故受照者NPB +FHC分析结果及估算的受照剂量 Table 4 Analysis of NPB+FHC and dose estimation at "5.7" accident in Nanjing

本研究使用的Y_1-7剂量-效应曲线估算的剂量虽然各不相同，但均不影响临床分度。根据染色体“dic+r”畸变分析是生物剂量估算的金标准，以及高估受照剂量的临床后果好于低估的原则，最终报告临床的剂量估算结果为：该例受照人员受到的照射为急性局部不均匀照射，身体受照份额为60%，全身等效剂量相当于一次急性全身均匀受照1.51 Gy (95% CI 1.40～1.61)。该估算结果与急性轻度骨髓型放射病的临床诊断相符。本例生物剂量估算结果显示，外周血淋巴细胞染色体“dic+r”畸变分析、CBMN分析、NPB +FHC分析均能有效估算急性外照射受照剂量，并且估算值相近，可以加强和相互验证估算的准确性。

长期以来，人们一直致力于研究开发快速、简便、准确的放射损伤生物剂量估算工具。其中，外周血淋巴细胞染色体畸变分析被视为最特异、最灵敏的生物剂量估算方法，这种技术具有低至0.1 Gy的检出下限，并能区分全身照射和局部照射，多年经验证明，其在放射剂量估算及指导医疗治疗方面有极好的可靠性，是国际公认的剂量估算的金标准。本研究的剂量估算结果再次证明了这一点，并且可以借助仪器，实现培养物处理的自动化、中期分裂相图像采集的自动化、剂量估算的高通量化^[10]。

20世纪90年代，国内开始将CBMN法用于多起辐射事故的生物剂量估算，取得了与染色体畸变剂量估算和临床诊断基本一致的结果。本研究的剂量估算结果证明了CBMN法的有效性。CBMN法可以与“dic+r”畸变分析法互相验证估算结果，并且也可以借助仪器实现培养物处理自动化、微核分析自动化^[10]。CBMN法的不足之处是培养时间比“dic+r”畸变分析法长，微核衰变快，本底高而且变异大，0.2～0.3 Gy的照射才能被探测到与本底差异有统计学意义^[11]。

NPB和FHC等早期染色体损伤生物标志物受到电离辐射后会明显增多，有可能成为新的有效的生物剂量计而备受关注^{[3, 4, 12, 13, 14]}。NPB+FHC法培养时间比“dic+r”畸变分析法长，样品分析比CBMN法复杂，体内衰减速率比“dic+r”畸变快，目前还无法借助遗传工作站提高分析速度，“dic+r”畸变分析和CBMN分析相比，目前还没有显示出优势，但作为一个新的、有效的生物剂量估算方法，值得做进一步研究和探讨。目前，在所有的生物剂量计中，“dic+r”畸变分析和CBMN分析依然是应用最广泛和最可靠的指标^[15]。

¹⁹²Ir在工业中常用，其γ能量平均为400 keV。一些实验室已经制备的¹⁹²Ir剂量-效应曲线显示其介于X射线和⁶⁰Co、¹³⁷Cs γ射线剂量-效应曲线之间，并且更接近于⁶⁰Co、¹³⁷Cs γ射线剂量-效应曲线，可以用⁶⁰Co γ射线建立的剂量-效应曲线来进行¹⁹²Ir的剂量估算^[3]。染色体畸变率不仅与受照剂量有关，也与剂量率、射线的能量相关。同一标本，使用不同剂量率、不同能量射线制备的剂量-效应曲线估算出的剂量是不同的。事故条件下几何位置的变化，使得受照部位的剂量率是不断变化的^[6]，但身体各受照部位的剂量率应该都小于源的剂量率。另外，由于¹⁹²Ir的能量低于⁶⁰Co，相同剂量率、相同剂量¹⁹²Ir γ射线所导致的染色体畸变要比⁶⁰Co γ射线少。基于以上两点，如选用⁶⁰Co γ射线制备的剂量-效应曲线对¹⁹²Ir γ射线造成的急性外照射病例进行生物剂量估算时，应选用剂量率偏小的剂量-效应曲线。

不同实验室建立的剂量-效应曲线的差异主要来自于样本制备、分析标准等环节。虽然国际标准化组织(ISO) 2004建议各实验室应建立自己的剂量-效应曲线^[16]，但建立高质量的剂量-效应曲线需要较大的人力投入，不是每个实验室都有条件建立高质量的剂量-效应曲线。本研究使用经标准源照射后制备的多个剂量点的标本，对其他实验室公开报道和惠赠的剂量-效应曲线进行测试，剔除估算值与实际照射值差距较大、不适合本实验室的剂量-效应曲线，保留相对偏差≤20%(照射剂量≥1 Gy)的剂量-效应曲线用于实际剂量估算。

在局部或高度不均匀照射时，生物剂量估算给出全身等效剂量的表达方式虽然很不确切^[17]，但本研究显示，对于局部不均匀急性照射，染色体畸变分析给出的一次全身等效剂量，相比使用染色体畸变不纯泊松分布法估算的受照份额及剂量与临床实际更加符合，更具有临床指导意义。可能是由于本例中的放射源与淋巴细胞、红骨髓丰富的部位距离较远，造成了一个类似全身均匀照射的结果。提示在某些情景下，对于急性局部不均匀照射，可以采用急性均匀照射的剂量-效应曲线进行全身等效受照剂量的估算。Prasanna等^[18]也认为在非均匀照射的情况下，估算的全身等效剂量可以考虑用于快速分类。而对于局部皮肤受照剂量则可以根据皮肤早期改变来进行估算，而不是使用染色体畸变分析、CBMN分析来进行剂量估算^[19]。