放射治疗是治疗肿瘤的一种重要手段，放疗在杀灭肿瘤细胞的同时，对机体正常组织尤其免疫系统造成一定的损伤和抑制作用，目前对于放疗引起的免疫损伤尚无非常有效的治疗方法。维生素D除了具有维持骨骼发育及钙磷调节作用以外，近年来，还发现其具有多种功能，包括免疫功能调节^[1]、肿瘤抑制功能^[2]等。但维生素D能否改善肿瘤放射治疗导致的免疫功能低下尚不清楚。本研究采用腹腔注射维生素D的方式，观察其对不同剂量X射线照射小鼠免疫功能的影响，以期为肿瘤放疗患者的免疫功能的改善提供实验依据。

1.主要仪器及试剂：X射线照射采用瑞典Elekta公司生产的AXESSE医用电子直线加速器；酶标仪购自美国BIO-RAD公司。1,25-二羟维生素D及ConA购自美国Sigma公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Amresco公司，RPMI 1640培养基及胎牛血清分别购自美国GIBCO公司和杭州四季青生物工程有限公司。细胞因子IL-2 ELISA试剂盒购自深圳欣博盛公司。

2.动物分组及给药方案：北京大学医学部实验动物医学研究中心饲养的6～8周龄健康ICR系小鼠共39只，采用随机数字表法分为5组：健康对照组(8只)，2 Gy照射组(7只)，5 Gy照射组(8只)，2 Gy+药物(维生素D)组(8只)，5 Gy+药物组(8只)。于实验第1天，单纯照射组及照射+药物组小鼠相应分别行2和5 Gy X射线照射，健康对照组小鼠进行假照射，照射后照射+药物组小鼠给予腹腔注射0.2 ml 6 IU维生素D/g体重，连续给药7 d；健康对照组和单纯照射组小鼠同期注射0.2 ml无菌注射用水。实验经本单位动物伦理委员会批准。

3.照射条件：单次全身照射，6 MV X射线，源轴距(SAD)101.5 cm，吸收剂量率为600 cGy/min，照射野为30 cm×30 cm。

4.小鼠体重、胸腺、脾脏大小的测定：分别于实验前和小鼠处死前，称量小鼠的体重，于实验的第8天断颈处死各组小鼠，取胸腺和脾脏，称重。胸腺和脾脏指数计算公式为：胸腺指数=(胸腺重量/小鼠体重)×1 000，脾脏指数=(脾脏重量/小鼠体重)×1 000。

5.小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的检测：无菌取脾，采用粗磨砂载玻片研磨，过200目细胞筛，制备脾细胞悬液，离心后加入红细胞裂解液，室温放置5～10 min，离心半径13.2 cm，1 000 r/min离心10 min，用PBS洗两次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基悬浮细胞，制备浓度为1×10⁷/ml的脾细胞悬液，96孔板每孔加100 μl脾细胞悬液，加100 μl ConA稀释液，ConA终浓度为5 μg/ml，空白孔不加ConA，加100 μl培养液，培养48 h，每孔加20 μl MTT，培养4 h，吸出上清，加100 μl DMSO，测定490 nm OD值，增殖指数为ConA孔OD值除以空白孔OD值。

6.小鼠脾细胞因子IL-2的检测：按上述方法制备脾细胞悬液及ConA刺激脾细胞培养48 h，吸取脾细胞上清液，分别加到1.5 ml离心管中，离心半径13.2 cm，1 500 r/min离心10 min，吸出上清转移到另一个离心管中，-80℃保存。按ELISA检测试剂盒说明书测定细胞上清液中IL-2浓度。根据标准品的浓度和OD值，应用Prism5.0软件绘制标准曲线，计算待检测样品中相应细胞因子的含量。

7.统计学处理：采用SPSS 18.0软件进行统计分析，数据以x± s 表示。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD法检验，方差不齐采用Dunnett法检验。两组间比较采用独立样本t检验。P <0.05为差异有统计学意义。

1.维生素D对小鼠体重、胸腺、脾脏质量的影响：同一剂量照射组与照射+药物组小鼠之间体重差异均无统计学意义(P>0.05)。2 Gy+药物组与2 Gy照射组相比，胸腺和脾脏质量均显著增加(t=-2.48、-2.14,P <0.05)。5 Gy+药物组与5 Gy照射组相比，胸腺质量显著增加(t=-4.71,P <0.05)，脾脏质量差异无统计学意义(P>0.05)，见表 1。

表1(Table 1)

表 1 维生素D对小鼠体重、胸腺质量、脾脏质量的影响Table 1 Effects of vitamin D on the weights of body, thymus and spleen of mice after radiation (g，x± s ) 组别 只数 实验前体重 实验后体重 脾脏质量 胸腺质量 健康对照组 8 28.3±1.80 28.3±1.84 0.115±0.016 0.086±0.017 2 Gy照射组 7 27.1±1.39 28.1±0.97 0.068±0.011 0.050±0.008 5 Gy照射组 8 27.0±1.50 27.8±1.73 0.042±0.008 0.042±0.009 2 Gy+药物组 8 26.8±1.49 26.8±1.35 0.093±0.029a 0.069±0.019a 5 Gy+药物组 8 28.2±1.21 28.2±1.25 0.055±0.013 0.064±0.009b 注：a与2 Gy照射组相比，t=-2.48、-2.14,P < 0.05；b与5 Gy照射组相比，tt=-4.71,P < 0.05

表 1 维生素D对小鼠体重、胸腺质量、脾脏质量的影响 Table 1 Effects of vitamin D on the weights of body, thymus and spleen of mice after radiation

2.维生素D对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响：2 Gy+药物组较2 Gy照射组小鼠胸腺指数及脾脏指数均显著升高(t=-2.54、-2.24，P <0.05)；5 Gy+药物组较5 Gy照射组胸腺指数显著升高(t=-5.02,P <0.05)；但脾脏指数差异无统计学意义(P>0.05)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 维生素D对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响Table 2 Effects of vitamin D on the thymus index and spleen index in mice after radiation (x± s ) 组别 只数 脾脏指数 胸腺指数 健康对照组 8 4.09±0.59 3.06±0.56 2 Gy照射组 7 2.41±0.36 1.77±0.32 2 Gy+药物组 8 3.50±1.23a 2.60±0.81a 5 Gy照射组 8 1.54±0.32 1.51±0.28 5 Gy+药物组 8 1.94±0.45b 2.27±0.32b 注：a与2 Gy照射组相比，t=-2.54、-2.24,P <0.05；b与5 Gy照射组相比，t=-5.02,P <0.05

表 2 维生素D对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响 Table 2 Effects of vitamin D on the thymus index and spleen index in mice after radiation

3.维生素D对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力的影响：健康对照组、2 Gy照射组、5 Gy照射组、2 Gy+药物组、5 Gy+药物组小鼠脾T淋巴细胞增殖指数分别为7.49±2.16、2.08±0.58、1.73±0.30、3.06±0.72、1.39±0.12。与健康对照组相比，2 Gy和5 Gy照射组脾细胞增殖指数均明显下降(F=36.20，P <0.05)。5 Gy与2 Gy照射组差异无统计学意义(P>0.05)。2 Gy+药物组与2 Gy照射组相比，脾细胞增殖指数上升(t=-2.84，P <0.05)，5 Gy+药物组与5 Gy照射组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

4.小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2浓度：健康对照组、2 Gy照射组、5 Gy照射组、2 Gy+药物组、5 Gy+药物组IL-2浓度分别为(79.17±21.17)、(40.17±26.69)、(16.47±3.39)、(27.90±11.07)、(22.18±6.33)pg/ml。与健康对照组相比，2和5 Gy照射组脾细胞IL-2分泌量显著下降(F=7.13，P <0.05)；5 Gy与2 Gy照射组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；2 Gy+药物组与2 Gy照射组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；5 Gy+药物组与5 Gy照射组相比，脾细胞IL-2分泌量上升显著(t=-2.64，P <0.05)。

研究发现，放疗在治疗肿瘤患者的同时，常引起其免疫功能的抑制，对病原微生物的抵抗力降低，易感染。因此，改善放疗患者的免疫功能对康复非常重要。

胸腺和脾脏是辐射作用的重要靶器官，同时也是人体内重要的免疫器官。Paranich等^[3]曾研究发现，小鼠脾脏细胞在2 Gy射线照射下开始失去其功能活性和形态结构特征，且随着辐射剂量的增加，这些变化过程越明显。胸腺细胞在2 Gy照射下，其功能活性会发生变化，但在10 Gy的剂量照射后，仍能维持一定的细胞膜参数及形态结构特征，表明脾脏细胞较胸腺细胞对射线更敏感。本研究结果显示，与健康对照组相比，2和5 Gy照射组小鼠胸腺、脾脏发生明显萎缩，胸腺、脾脏指数显著降低，ConA诱导的T淋巴细胞增殖能力显著降低，5 Gy照射时小鼠脾脏指数下降(61%)较胸腺指数下降(42%)更明显，说明不同免疫组织对X射线的敏感性不同。

研究发现，维生素D可通过与免疫细胞上的特异性维生素D受体结合^[4]，直接或间接作用于淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞，而发挥其对机体免疫功能的调控作用^[5]。Yang等^[6]研究显示，维生素D缺乏可以引起脾淋巴细胞增殖能力减弱，CD4+和CD8+T细胞数量减少等免疫功能降低的现象。此外，宋淑军等^[7]利用糖皮质激素诱导的小鼠免疫抑制模型，通过腹腔注射维生素D，能够显著增强免疫抑制模型小鼠胸腺指数、脾脏指数以及脾脏T淋巴细胞增殖能力。维生素D是否可以改善辐射引起的免疫抑制少见报道。

本研究结果显示，维生素D可以显著改善照射小鼠胸腺和脾脏指数的降低；特别是2 Gy剂量照射组，维生素D可以使胸腺指数及脾脏指数增加至单纯照射组的近1.5倍，恢复到对照组的80%以上。经腹腔注射维生素D 6 IU/g体重后，其中2 Gy+药物组、5 Gy+药物组小鼠胸腺指数均显著高于同剂量单纯照射组，且2 Gy+药物组胸腺指数水平恢复至接近健康对照组水平，脾脏指数水平恢复至健康对照组水平的85.6%，5 Gy+药物组胸腺指数恢复至健康对照组的68%，而脾脏指数只恢复至健康对照组的47%。表明维生素D可以显著改善2 Gy X射线辐射所致的免疫功能抑制和5 Gy X射线辐射所致的部分免疫功能抑制；脾脏较胸腺不仅更容易受到辐射的损伤，而且损伤修复可能更困难，其具体机制有待进一步研究。

IL-2也称为T细胞生长因子，主要是由活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞产生分泌^[8]，因此，脾脏细胞IL-2的水平可以反映T淋巴细胞的免疫状态。本实验结果显示：2和5 Gy组脾细胞IL-2的分泌量较健康对照组分别下降了约26.8%、38.9%；表明辐射可以降低脾脏T淋巴细胞IL-2的分泌，而照射+药物组特别是5 Gy+药物组，可以使小鼠脾细胞IL-2分泌量增加至单纯照射组的1.6倍，恢复到健康对照组的90%以上。表明维生素D可以显著改善辐射所引起的IL-2分泌的减少，免疫功能抑制，但其机制尚不清楚。

总之，2 Gy X射线照射下，维生素D对免疫功能降低的改善作用明显，而5 Gy X射线照射下，改善作用减弱。本研究为临床应用维生素D进行辐射引起的免疫损伤防护提供了实验依据。