中波紫外线(ultraviolet B，UVB)是指波长在280～320 nm的紫外辐射。虽然到达地球表面的紫外线中，UVB含量不到5%，但却是导致皮肤过度增生、炎症的重要因素。另外，UVB还可诱导辐射敏感基因表达改变，如miR-365、miR-21等，进而可能引起皮肤鳞癌的发生发展^{[1, 2]}。由于工业生产过程的需要，相关职业人群接触UVB的频率越来越高，因此，研究UVB对细胞损伤的机制对于紫外辐射防护有重要意义。

研究表明，14-3-3σ基因是抑癌基因p53的下游靶基因，在DNA损伤诱导的细胞G₂/M期阻滞过程中发挥重要作用，缺乏14-3-3σ会导致细胞的死亡^[3]。前期研究发现，UVB能诱导HaCaT细胞14-3-3σ表达水平升高，为了进一步明确UVB诱导的14-3-3σ表达的改变是否会引起细胞增殖、周期等特性的变化，以及相关信号通路中功能蛋白的表达改变，本研究利用前期研究中已构建的14-3-3σ干扰HaCaT细胞(命名为HaCaT^KD14-3-3σ细胞^[4])来探索14-3-3σ在UVB诱导的HaCaT细胞辐射损伤中的作用。

1.主要试剂与设备：高糖DMEM培养液(美国GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；结晶紫(广州威佳生物公司)；蛋白酶抑制剂(美国Roche公司)；CCK-8试剂盒(北京TransGen Biotech公司)；ECL显色液(德国Merck Millipore公司)；细胞周期试剂盒(南京凯基生物公司)；14-3-3σ单克隆抗体(德国Merck Millipore公司)；周期蛋白相关蛋白抗体Cdc2、Cdc25c和Cyclin B1(德国Merck Millipore公司)；核糖核酸酶(RNases A，美国Sigma公司)；FACS guava流式细胞仪(德国Merck Millipore公司)；细胞计数软件Adobe Photoshop CS3(美国Adobe公司)；紫外照射源(上海顾村光电仪器厂)。

2.细胞来源与培养：人角质形成细胞HaCaT购自武汉典型培养物保藏中心(CCTCC)。稳定干扰细胞系HaCaT^KD14-3-3σ由本实验室前期构建(详见参考文献[4])。正常HaCaT细胞培养在含体积分数为10%的新生牛血清、100 U/ml的青、链霉素双抗的DMEM培养液中，于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中常规培养，HaCaT^KD细胞额外加入终浓度为100 μg/ml的Geneticin(G418)。

3.UVB照射：紫外光源波长为305 nm，样品与光源垂直距离40 cm时功率密度0.165 W/cm²。细胞接种于直径10 cm的培养皿中，待细胞长至70%～80%融合时，弃培养基，先用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2遍，然后加入5 ml PBS覆盖皿底，将培养皿放进紫外光源箱体指定位置照射，照完后弃PBS缓冲液并重新加入含体积分数10%新生牛血清的高糖DMEM培养液继续培养。

4.结晶紫染色：在3.5 cm的皿中，HaCaT细胞和HaCaT^KD均按每皿3×10⁵细胞接种，待HaCaT细胞长至70%～80%融合度时，两种细胞分别用0、10、20、30、40、50、60和80 mJ/cm²的剂量照射后48 h结晶紫染色，×200显微镜下随机拍照5个视野，计算平均细胞数，以未照组(0 mJ/cm²)为参照，实验重复3次。

5.CCK-8法检测细胞增殖：在96孔板中，HaCaT细胞和HaCaT^KD按每孔接种8×10³细胞，每孔100 μl的细胞悬液，培养24 h后UVB照射，分别在照后0、12、24、48和72 h时间点每孔加入10 μl的CCK-8溶液，继续培养2 h，测450 nm的吸光度(A₄₅₀)值。实验重复3次。

6.PI单染检测细胞周期：HaCaT细胞和HaCaT^KD按1×10⁶细胞分别接种在6 cm皿中，在接种后0、6、12、18和24 h收集细胞，PI单染检测细胞周期。HaCaT细胞和HaCaT^KD细胞按1×10⁶细胞分别接种在6 cm皿中，待HaCaT细胞长至70%～80%融合度时，两组细胞分别接受30 mJ/cm²的UVB照射，在照后0、6、12、18和24 h收集细胞，PI单染检测细胞周期。PI单染检测细胞周期按试剂盒说明检测。实验重复3次。

7.Western blot蛋白检测：HaCaT细胞和HaCaT^KD细胞按同种密度接种，待HaCaT细胞长至70%～80%融合度时，分别接受UVB照射。在照射后0、6、12、18和24 h收集细胞，提取细胞总蛋白。每孔加入20 μg蛋白，5%的浓缩胶和10%的分离胶进行电泳，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗后用相应二抗室温孵育1 h，ECL发光试剂盒检测发光强度。实验重复3次。

8.统计学处理：结果以x± s 表示，采用SPSS 21.0软件分析。多个实验组与对照组均数的比较采用方差分析的Dunnett-t检验，两因素多时间点资料采用析因方差分析，两样本均数的比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.不同剂量UVB照射后48 h HaCaT与HaCaT^KD细胞密度的变化：结果见图 1，表 1。两种细胞的细胞密度均呈剂量依赖性下降(图 1)。由表 1可知，正常HaCaT细胞未照射与HaCaT^KD细胞未照射相比，差异有统计学意义(t=10.58，P＜0.05)。与未照射相比，正常HaCaT细胞在≥20 mJ/cm²照射后可出现显著抑制(t=19.18～46.91，P＜0.05)；HaCaT^KD细胞中在≥10 mJ/cm²照射后即可出现显著抑制(t=8.83～49.63，P＜0.05)。

图 1(Figure 1)

图 1 不同剂量的UVB照后48 h HaCaT和HaCaTKD的细胞的汇合度 Figure 1 The confluence of HaCaT and HaCaTKD cells treated with different doses of UVB irradiation after 48 h incubation

表 1(Table 1)

表 1 不同剂量的UVB照射后48 h HaCaT和HaCaTKD的细胞数Table 1 The cells numbers after HaCaT, HaCaTKD cells being treated with different doses of UVB after 48 h (x± s ) 细胞 样本数 0 mJ/cm2 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2 30 mJ/cm2 40 mJ/cm2 50 mJ/cm2 60 mJ/cm2 80 mJ/cm2 HaCaT 5 830±30 767±42 626±14a 308±10a 138±21a 74±14a 34±10 a 8±4a HaCaTKD 5 580±20 a 442±8 b 167±13 b 105±12 b 32±11 b 14±3 b 5±2 b 4±2 b 注： a与HaCaT细胞0 mJ/cm2组相比，t=10.58、28.42、32.31、39.57、43.36、46.91、19.18，P＜0.05；b 与HaCaTKD细胞0 mJ/cm2组相比，t=8.83、29.90、34.83、41.46、48.39、49.36、49.63，P＜0.05

表 1 不同剂量的UVB照射后48 h HaCaT和HaCaTKD的细胞数 Table 1 The cells numbers after HaCaT, HaCaTKD cells being treated with different doses of UVB after 48 h

2.未照射或30 mJ/cm²的UVB照射后HaCaT与HaCaT^KD细胞增殖情况：经析因方差分析，正常HaCaT组和HaCaT^KD组在不同时间点A值，分组和时间之间存在交互作用(F=2.98，P＜0.05)。HaCaT^KD细胞的增殖能力显著低于HaCaT细胞(F=32.89，P＜0.01)。同一时间点对两组进行组间比较，除了48和72 h时间点HaCaT组值大于HaCaT^KD组(F=9.47、11.85，P＜0.05)，其他时间点差异无统计学意义(P＞0.05)。固定分组进行不同时间点比较，差异均有统计学意义(F=42.86、58.39，P＜0.05)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 未照射的HaCaT和HaCaTKD细胞增殖情况Table 2 The proliferation rates of HaCaT and HaCaTKD cells without irradiation (A值,x± s ) 细胞 样本数 0 h 12 h 24 h 48 h 72 h F值 P值 HaCaT 3 0.69±0.01 0.98±0.10 1.28±0.13 1.71±0.16 1.90±0.18 42.86 < 0.05 HaCaTKD 3 0.65±0.05 0.86±0.04 1.06±0.07 1.37±0.09 1.48±0.11 58.39 < 0.05 F值 P值 1.59 >0.05 4.14 >0.05 6.01 >0.05 9.47 < 0.05 11.85 < 0.05 32.89 < 0.05

表 2 未照射的HaCaT和HaCaTKD细胞增殖情况 Table 2 The proliferation rates of HaCaT and HaCaTKD cells without irradiation

照射后，经析因方差分析UVB+HaCaT组和UVB+HaCaT^KD组在不同时间点A值的结果，分组和时间之间存在交互作用(F=31.33，P＜0.05)。HaCaT^KD细胞的增殖能力低于HaCaT细胞(F=269.5，P＜0.05)。同一时间点对两组进行组间比较，除0 h外，其他时间点差异均有统计学意义(F=8.89、66.82、80.28、190.49，P＜0.05)。固定分组进行不同时间点比较，差异均有统计学意义(F=28.85、10.23，P＜0.05)，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 30 mJ/cm2 UVB照射后HaCaT和HaCaTKD细胞增殖情况Table 3 The proliferation of HaCaT, HaCaTKD cells treated with 30 mJ/cm2 UVB irradiation (A值,x± s ) 细胞 样本数 0 h 12 h 24 h 48 h 72 h F值 P值 HaCaT 3 0.70±0.02 0.74±0.03 0.86±0.07 0.95±0.07 1.11±0.06 28.85 < 0.05 HaCaTKD 3 0.66±0.08 0.61±0.07 0.41±0.06 0.39±0.08 0.36±0.08 10.23 < 0.05 F值 P值 0.96 >0.05 8.89 < 0.05 66.82 < 0.05 80.28 < 0.05 190.49 < 0.05 269.59 < 0.05 注：分组和时间之间存在交互作用，F＝31.33，P < 0.05

表 3 30 mJ/cm2 UVB照射后HaCaT和HaCaTKD细胞增殖情况 Table 3 The proliferation of HaCaT, HaCaTKD cells treated with 30 mJ/cm2 UVB irradiation

3.未照射和30 mJ/cm² UVB照射后两组细胞培养不同时间G₂/M期变化情况：见表 4，5。未照射情况下，HaCaT细胞中处于G₂/M期的细胞在6 h开始升高，12 h出现一个峰值，18 h显著下降，且这3个点和0 h相比，差异均具有统计学意义(t=4.93、3.61、7.59，P＜0.05)，24 h回到0 h的水平，差异无统计学意义(P＞0.05)。而HaCaT^KD细胞各观察时间点与0 h相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表 4(Table 4)

表 4 HaCaT和 HaCaTKD细胞分别培养不同时间细胞周期的分布情况Table 4 Cell cycle distribution of HaCaT and HaCaTKD cells at different time points (%，x± s ) 细胞 细胞周期 样本数 0 h 6 h 12 h 18 h 24 h HaCaT G1/G0 3 36.54±1.06 34.40±33.98 33.98±1.84 44.38±0.81 35.72±1.37 S 3 50.75±2.45 47.53±2.62 46.91±2.95 51.42±1.85 53.85±2.10 G2/M 3 12.71±1.51 18.03±1.05a 19.11±2.66 a 4.20±1.15 a 10.43±1.77 HaCaTKD G1/G0 3 37.11±1.58 31.68±2.20 34.65±1.26 34.43±1.46 35.00±1.56 S 3 51.39±2.95 52.74±1.43 49.23±2.09 50.44±2.38 52.00±3.24 G2/M 3 11.50±1.51 15.58±1.03 16.12±1.73 15.13±1.10 13.00±1.71 a与同一周期0 h比较, t=4.93、3.61、7.59，P＜0.05

表 4 HaCaT和 HaCaTKD细胞分别培养不同时间细胞周期的分布情况 Table 4 Cell cycle distribution of HaCaT and HaCaTKD cells at different time points

表 5(Table 5)

表 5 HaCaT和HaCaTKD细胞接受30 mJ/cm2UVB照射后不同时间点细胞周期的分布情况Table 5 Cell cycle distribution of HaCaT and HaCaTKD cells at different time points after 30 mJ/cm2 UVB treatment (%，x± s ) 细胞 细胞周期 样本数 0 h 6 h 12 h 18 h 24 h HaCaT G1/G0 3 35.85±1.36 30.12±1.13 29.50±1.72 28.46±0.78 33.47±1.59 S 3 51.73±2.51 47.26±0.96 45.21±2.12 45.04±2.17 51.54±2.70 G2/M 3 12.42±1.15 22.62±2.09 a 25.29±2.13 a 26.49±2.40 a 14.99±1.77 HaCaTKD G1/G0 3 43.35±1.16 39.13±1.37 44.57±1.55 51.20±1.14 43.08±1.24 S 3 43.63±1.48 42.48±1.14 41.23±1.01 37.05±2.33 49.92±1.20 G2/M 3 13.02±0.54 18.39±1.28 14.20±1.43 11.75±2.18 7.00±1.05 注：a与同一周期0 h比较, t=7.41、9.22、9.16，P＜0.05

表 5 HaCaT和HaCaTKD细胞接受30 mJ/cm2UVB照射后不同时间点细胞周期的分布情况 Table 5 Cell cycle distribution of HaCaT and HaCaTKD cells at different time points after 30 mJ/cm2 UVB treatment

UVB照射情况下，HaCaT细胞在照后6～18 h发生G₂/M期细胞比例上升，与0 h相比，差异均有统计学意义(t=7.41、9.22、9.16，P＜0.05)；而HaCaT^KD细胞在照后6 h时G₂/M期短暂升高后逐渐下降，未见明显G₂/M期阻滞作用(P>0.05)。

4.UVB照射后14-3-3σ及下游周期相关蛋白表达情况：结果见图 2。正常的HaCaT照后6、12、18、24 h与照射前比较，14-3-3σ表达量显著升高，Cdc2下调，24 h未见回升，Cdc25c、Cyclin B1下调，Cdc25c在24 h略有回升，Cyclin B1在18、24 h略有回升。在HaCaT^KD细胞中，照后24 h与照射前比，14-3-3σ表达量升高较明显；照后12、18、24 h，Cdc25c、Cyclin B1下调，Cdc2表达量在各时间点无显著改变。

图2(Figure 2)

图 2 UVB照射后不同时间点HaCaT与HaCaTKD细胞中相关蛋白表达 Figure 2 The expression of proteins at different time points after HaCaT and HaCaTKD being irradiated with UVB

照射后24 h，HaCaT^KD组、HaCaT^KD+UVB组、HaCaT组与HaCaT+UVB组相比，HaCaT^KD+UVB组的14-3-3σ表达量低于正常HaCaT组，HaCaT^KD组与HaCaT^KD+UVB组的Cdc2表达量不变，正常HaCaT组与HaCaT+UVB组的Cdc2表达量相对下降(图 3)。

图 3(Figure 3)

注：1.HaCaTKD；2.HaCaTKD+UVB；3.HaCaT；4.HaCaT+UVB图3 两种细胞UVB照后24 h 14-3-3σ和Cdc2的表达 图 3 两种细胞UVB照后24 h 14-3-3σ和Cdc2的表达 Figure 3 The expression of 14-3-3σ and Cdc2 in four treatment groups at 24 h after UVB irradiation

各种损伤引起细胞DNA破坏后，细胞一方面可通过启动凋亡信号通路诱导细胞凋亡，另一方面，不同细胞也可能会诱导周期阻滞，为DNA损伤修复提供条件^[5]。14-3-3σ基因是抑癌基因p53的下游靶基因。研究发现，在DNA损伤诱导的细胞G₂/M期阻滞中，14-3-3σ是发挥重要作用的蛋白之一，当缺乏14-3-3σ时,则会导致细胞增殖抑制，进而导致细胞死亡^[6]。同时，14-3-3σ还可能通过bad和bcl-x的凋亡信号通路发挥抗凋亡作用^[7]。本研究主要通过体外培养人角质形成细胞(HaCaT细胞)，观察UVB辐射损伤后HaCaT细胞增殖、凋亡、周期等变化情况，并探讨14-3-3σ在其中发挥的作用。

结晶紫染色实验说明14-3-3σ的低表达能使细胞增殖能力下降，与CCK-8法观测的结果相一致。随着UVB照射剂量的增加，照后各组细胞的密度均呈剂量依赖性下降。HaCaT^KD细胞10 mJ/cm²照射时就已经出现显著抑制，而正常HaCaT细胞在20 mJ/cm²照射时才可见显著抑制。CCK-8实验结果发现，在不经UVB照射的情况下，HaCaT细胞的增殖速率显著高于HaCaT^KD细胞，因此，可以认为抑制14-3-3σ的表达会影响细胞增殖速率。进一步检测两组细胞在30 mJ/cm²的UVB照射后增殖情况发现，随着观察时间的延长，HaCaT细胞在照后24 h开始出现增殖，至72 h可达到照前的1.6倍。但UVB照后，HaCaT^KD未见增殖，至72 h仍未见恢复，因此，可以认为14-3-3σ是影响增殖的重要基因，而它的缺失则可能导致HaCaT细胞对UVB辐射更加敏感。

细胞周期进程的改变是影响细胞增殖能力的因素之一，为明确HaCaT^KD细胞的增殖抑制是否由细胞周期进程改变引起，本研究观察了两组细胞分别在不接受UVB照射和接受30 mJ/cm²的UVB照射后不同培养时间的细胞周期的分布情况。结果显示，未加UVB处理时，HaCaT细胞中处于G₂/M期的细胞表现为先升高后恢复，这符合细胞增殖特性，但HaCaT^KD细胞在接种的各个点，G₂/M期的细胞均处于比较低的水平，即细胞未进入分裂期，与结晶紫及CCK-8实验的结果相一致，也和Vogel等^[6]的研究结果相同。在接受UVB照射后，HaCaT细胞在6~18 h发生明显的G₂/M期阻滞，而HaCaT^KD细胞则未出现G₂/M期阻滞。综合结晶紫、CCK-8和细胞周期的实验结果，可以推论，14-3-3σ是影响细胞增殖和细胞周期分布的关键因素之一，且其表达情况对HaCaT细胞接受UVB照射后的应答反应也发挥了重要作用。

Zhang等^[8]指出，Cdc25c脱磷酸化激活Cdc2，进而激活MPF(Cdc2和Cyclin B1的复合体)，促使细胞由G₂期向M期转换。本研究中，观察到HaCaT和HaCaT^KD细胞在UVB照后不同时间点的14-3-3σ及下游周期蛋白Cdc25c、Cyclin B1、Cdc2的差异表达，即HaCaT细胞中14-3-3σ在照后6 h即升高，并维持到24 h，伴随14-3-3σ升高，Cdc25c、Cyclin B1和Cdc2却自6 h明显下降，至24 h仅微弱恢复；HaCaT^KD细胞在UVB照射后，14-3-3σ升高程度较弱，至24 h才升高较明显，Cdc2的表达无改变，Cdc25c和Cyclin B1表达的下降延迟到照后12 h，到24 h仍未见恢复。结合细胞周期的实验结果，可以推论UVB照射能诱导14-3-3σ的表达，从而下调Cdc2、Cdc25c和Cyclin B1的表达来诱导HaCaT细胞发生G₂/M期阻滞，而下调14-3-3σ的表达，能解除其对Cdc2的抑制，并延迟Cdc25c和Cyclin B1的下调，从而解除G₂/M期阻滞，诱导细胞发生凋亡或死亡。这和Gao等^[9]研究的结果相一致，即DNA损伤后可诱导Cyclin B1的下降来影响周期的变化。但也有研究显示对Cdc25c在14-3-3σ诱导的G₂/M期阻滞中的作用有相反的结果，Li等^[10]、Ou等^[11]、Telles等^[12]认为是14-3-3蛋白家族中的其他亚型，而非14-3-3σ可调节Cdc25c的表达而发挥对细胞周期的作用。出现这种情况的原因可能是14-3-3σ在不同细胞中应答反应不同。

综上所述，UVB诱导的14-3-3σ的表达是HaCaT细胞对UVB辐射损伤应激的保护机制之一，其能通过抑制下游蛋白Cdc2、Cdc25c、Cyclin B1的表达诱导G₂/M期阻滞以提高细胞存活率。