放疗是恶性肿瘤治疗的三大手段之一，然而很多肿瘤对放疗耐受成为制约放疗效果的一大难题，寻找一种高效、低毒的放射增敏剂是当前研究的热点。有研究证实，氯喹对乳腺癌、脑胶质瘤等肿瘤有放射增敏作用^{[1, 2]}。氯碘羟喹(CQ)作为氯喹衍生物，与锌离子化合物联用能增加肿瘤细胞内锌离子水平，从而发挥抗肿瘤效应^{[3, 4]}。锌离子是维持正常细胞生长代谢的一种必需元素，在大多数肿瘤细胞中含量减少或缺乏^[5]，有研究发现补充细胞内锌离子增加了蒽环霉素对肿瘤细胞DNA的损伤^[6]，抵消肿瘤细胞乏氧表型，增加肿瘤细胞对化学治疗的敏感性^{[7, 8]}。而CQ联合锌离子是否能增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感性尚未见报道。本实验探讨氯碘羟喹(CQ)联合锌离子(zinc)对人宫颈癌HeLa细胞系的放射增敏作用，为CQ联合锌离子应用于临床恶性肿瘤的放射治疗提供实验基础。

1.细胞、试剂与仪器：人宫颈癌HeLa细胞系购于中国科学院上海细胞库；氯碘羟喹、氯化锌、二甲基亚枫(DMSO)购于美国Sigma公司；类胎牛血清和MEM培养基购于美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购于日本同仁公司；细胞周期与凋亡试剂盒购于上海贝博生物公司；荧光素酶活性检测试剂盒购于美国Promega公司，直线加速器为德国西门子公司PRIMUS型。

2.细胞培养：HeLa细胞接种于MEM培养基(含10%类胎牛血清及青霉素、链霉素各100 U/ml)，在37℃、5%CO₂、饱和湿度恒温培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。所有实验均在细胞指数生长期进行。

3.实验分组：实验分对照组、药物组、单纯照射组、药物+照射组。对照组用含有DMSO的MEM培养基处理；药物组用含有5 μmol/L CQ和10 μmol/L ZnCl₂的MEM培养基处理；单纯照射组用不同剂量X射线处理；药物+照射组用5 μmol/L CQ和10 μmol/L ZnCl₂的药物预处理4 h后，再用不同剂量X射线处理。

4.照射条件：6 MV X射线，源靶距100 cm，射野面积35 cm×35 cm，吸收剂量率200 cGy/min。

5.CCK-8法检测药物对细胞增殖的影响：用含10%类胎牛血清的MEM培养基将HeLa细胞悬液密度调制2×10⁴/ml，接种于96孔板，2 000/孔。CQ单独作用于HeLa细胞时IC₁₀和IC₁₅约为6和10 μmol/L，数据未给出，考虑一分子CQ最多可以结合两分子锌离子，故固定CQ浓度为5 μmol/L，调整锌离子浓度找出最佳抑制浓度。培养24 h贴壁后，加入5 μmol/L CQ和0、5、10、20、50、100 μmol/L ZnCl₂溶液，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养72 h，每孔加入10 μl的CCK-8试剂，2.5 h后用酶标仪读取各孔吸光度(A)值，选择波长为450 nm。对照组用含有DMSO的MEM培养基处理。实验重复3次。细胞抑制率(%)=1-(实验组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)×100%。

6.集落形成实验检测对细胞放射敏感性的影响：取对数生长期细胞制备细胞悬液，接种于6孔板(0、0.5、1、4、6、8、10 Gy分别接种100、100、200、400、800、1 000、2 000个细胞)。于含10%类胎牛血清的MEM培养基中培养24 h，弃去培养基，给予药物处理，使CQ和ZnCl₂的终浓度分别为5和10 μmol/L，继续培养4 h后分别给予不同剂量(0、0.5、1、2、4、6、8、10 Gy)X射线照射，每个剂量分设6个平行样，照射后继续培养14 d，甲醇固定，结晶紫染色，计数≥50个细胞的克隆，计算细胞存活分数(SF)，SF=实验中克隆数/接种细胞数×PE，PE为0 Gy时集落形成率，用GraphPad Prism 5.0软件根据单击多靶模型SF=1-(1-e-D^/D0)^N拟合剂量-存活曲线，计算平均致死剂量D₀、准阈剂量D_q、SF₂、放射增敏比(SER)等放射生物学参数，其中D_q/D₀=logN。

7.细胞周期检测：将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中，分为单纯照射组和药物+照射组，每组3个平行样。于照射前4 h，弃去旧培养基，在药物+照射组中加入CQ和ZnCl₂，使CQ和ZnCl₂的终浓度分别为5和10 μmol/L；在单纯照射组中加入含DMSO的培养基，培养箱培养4 h后用6 Gy X射线照射，射线照射后24 h收集细胞，并用70%乙醇固定。RNA酶消化，碘化丙啶(PI)染色(4℃避光染30 min)后立即用流式细胞仪检测细胞周期。

8.细胞凋亡检测：将对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中，分设对照组、药物组、单纯照射组、药物+照射组，每组设3个平行样。在完全培养基中培养24 h后，在药物组、药物+照射组中加入5 μmol/L CQ和10 μmol/L zinc，在对照组、单纯照射组加入含DMSO的培养基，单纯照射组和药物+照射组用10 Gy X射线处理，照射前4 h加药处理。照射后继续培养24 h后，用不含EDTA胰酶消化细胞，离心半径6 cm，转速1 000 r/min，离心5 min，收集细胞，并用预冷PBS洗涤2次，分别加入Annexin V和PI染液，避光染色15 min后流式细胞仪检测凋亡。

9.质粒转染和荧光素酶活性检测：取对数生长期细胞HeLa细胞接种于100 mm培养皿中，细胞密度为70%～80%时，用Lipo2000将含有NF-κB报告基因的质粒(pNF-κB-Luc)转染细胞，转染24 h后，将转染细胞消化并接种于96孔板，20 000/孔，分设对照组、药物组、单纯照射组、药物+照射组，每组3个平行样。转染48 h后在药物组和药物+照射组加入5 μmol/L CQ和10 μmol/L ZnCl₂，加药4 h后单纯照射组和药物+照射组用2 Gy X射线处理，射线处理24 h后进行荧光素酶活性检测，每孔加入20 μl细胞裂解液(CCLR)和100 μl荧光素酶检测底物(LAR)(避光处理)，立即用酶标仪读取荧光值。

10.统计学处理：采用SPSS 22.0统计软件分析。实验数据以x± s 表示，组间两两比较采用t检验，各组间比较采用单因素方差分析。P <0.05为差异有统计学意义。

1.氯碘羟喹联合氯化锌对人宫颈癌HeLa细胞的生长抑制作用：结果见表 1。氯碘羟喹联合氯化锌对HeLa细胞的抑制率随着药物浓度的增加而升高(F=188.00，P <0.01)。当5 μmol/L CQ+10 μmol/L zinc作用时间为72 h时，细胞抑制率为15.88%，与对照组比较，差异有统计学意义(t=12.17，P < 0.05)，选用作放射增敏的实验研究。

表 1(Table 1)

表 1 CCK-8法检测5 μmol/L氯碘羟喹联合不同浓度氯化锌 作用72 h后HeLa细胞生长抑制率Table 1 Cytotoxicity of 5 μmol/L CQ combined with different concentrations of zinc on HeLa cell proliferation after 72 h of drug treatment (x± s ) 药物浓度(μmol/L) 样本量 吸光度(A)值 抑制率(%) 对照组 6 1.237±0.028 0 CQ+0 μmol/L zinc 6 1.134±0.067 8.55±5.01 CQ+5 μmol/L zinc 6 1.124±0.109 9.42±6.85 CQ+10 μmol/L zinc 6 1.039±0.046 15.88±2.92 CQ+20 μmol/L zinc 6 0.985±0.057 20.44±3.98 CQ+50 μmol/L zinc 6 0.515±0.069 58.29±6.23 CQ+100 μmol/L zinc 6 0.238±0.033 80.70±2.98 F值 188.00 P值 < 0.01 注：CQ. 氯碘羟喹；zinc.锌离子。a与对照组比较，t=12.17,P < 0.05

表 1 CCK-8法检测5 μmol/L氯碘羟喹联合不同浓度氯化锌 作用72 h后HeLa细胞生长抑制率 Table 1 Cytotoxicity of 5 μmol/L CQ combined with different concentrations of zinc on HeLa cell proliferation after 72 h of drug treatment

2.集落形成实验观察CQ+zinc对HeLa细胞的放射增敏作用：在相同照射剂量下，药物+照射组的细胞存活分数均低于单纯照射组，根据单击多靶模型拟合剂量-存活曲线见图 1。单纯照射组和药物+照射组的SF₂分别为0.65和0.48；D₀分别为3.16和2.04 Gy；D_q分别为0.73和0.35 Gy。药物+照射组与单纯照射组相比，D₀、D_q、SF₂均降低，放射增敏比为1.55，表明CQ+zinc对HeLa细胞有明显的放射增敏效应。

图 1(Figure 1)

图 1 单击多靶模型拟合的HeLa细胞存活曲线图 Figure 1 Dose curves of cell survival stimulated by the single-hit multi-target model

3.流式细胞仪观察药物联合X射线对HeLa细胞周期的影响：结果见表 2。药物组和对照组相比，G₁、S、G₂/M期均无明显差异；与单纯照射组相比，药物+照射组G₂期减少，G₁期增加，差异有统计学意义(t=10.39、23.15，P < 0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 药物联合X射线作用于HeLa细胞周期变化Table 2 Effect of drugs on HeLa cell cycle distribution after radiation (%，x± s ) 组别 样本数 G0/G1 S G2/M 对照组 3 50.14±4.90 31.19±3.33 18.67±1.59 药物组 3 48.40±5.24 31.05±4.40 20.55±1.40 单纯照射组 3 18.12±4.39 33.94±3.07 47.94±5.71 药物+照射组 3 41.52±4.18a 29.60±6.74 28.88±3.15b 注：与同一周期单纯照射组比较，at=10.39，P < 0.05；b t=23.15，P < 0.05

表 2 药物联合X射线作用于HeLa细胞周期变化 Table 2 Effect of drugs on HeLa cell cycle distribution after radiation

4.流式细胞仪观察CQ+zinc联合X射线对HeLa细胞凋亡的影响：结果见图 2。药物组与对照组相比，凋亡率由(12.64±1.58)%增加到(18.91±4.25)%，差异有统计学意义(t=3.39，P <0.05)；药物+照射组与单纯照射组相比，凋亡率由(23.04±1.44)%增加到(30.46±2.88)%，差异有统计学意义(t=5.64，P <0.01)。

图 2(Figure 2)

注：Q1.坏死细胞；Q2.晚期凋亡细胞；Q3.正常活细胞；Q4.早期凋亡细胞 图 2 药物联合X射线对HeLa细胞凋亡的影响 A.对照组；B.药物组；C.单纯照射组；D.药物+照射组 Figure 2 Effect of drugs on radiation-induced apoptosis in HeLa cells A. Control group；B. Drug group； C. Radiation group；D. Drug + irradiation group

5.NF-κB活性检测：对照组、药物组、单纯照射组、药物+照射组的荧光值分别为(1.17±0.103)×10⁶、(0.38±0.074)×10⁶、(1.62±0.101)×10⁶和(0.46±0.039)×10⁶。与对照组相比，单纯照射组NF-κB活性升高，差异有统计学意义(t=6.23，P <0.05)，提示射线可激活HeLa细胞NF-κB活性；药物组NF-κB活性明显下降，差异有统计学意义(t=12.48，P <0.05)，提示药物可抑制HeLa细胞NF-κB活性。与单纯照射组比较，药物+照射组NF-κB活性明显下降，差异有统计学意义(t=21.42，P <0.05)，提示药物可抑制射线导致的HeLa细胞NF-κB活性升高。

CQ是一种金属螯合剂，能与锌、铁、铜等金属离子稳定结合，最早用来治疗腹泻和皮肤感染^[9]。锌离子是人体必需的一种微量元素，目前多项研究证实多种肿瘤中存在锌离子缺乏，锌离子缺乏与正常细胞恶性转化密切相关^[10]，而补充锌离子治疗能抑制肿瘤细胞生长，改善细胞乏氧表型，影响肿瘤细胞对抗癌治疗的反应性^[11]。用锌处理前列腺癌细胞能增加其对紫杉醇诱导凋亡的敏感性^[12]。前期研究证实，CQ联合锌离子化合物能抑制人前列腺癌细胞和卵巢癌细胞的生长，其主要机制是CQ通过调节细胞内锌离子水平，促进肿瘤细胞凋亡。目前关于CQ联合锌离子对HeLa细胞的作用尚未报道，本研究发现CQ联合锌离子对HeLa细胞的抑制作用呈浓度依赖性，与前期研究一致。高浓度药物对HeLa细胞有明显的细胞毒性，而低浓度时细胞毒性很小，用低浓度药物联合X射线处理HeLa细胞与单独射线处理组相比，平均致死剂量降低，放射增敏比为1.55，说明低浓度药物对HeLa细胞产生明显的放射增敏效应。

影响细胞的放射敏感性的因素很多，比如DNA损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、胞内信号转导等。细胞在受到射线辐射时，通常会激活G₁/S期和G₂/M期这两个细胞周期检查站点，进而导致细胞停滞在G₁期或G₂期有利于损伤的修复。p53是调控G₁期检查点的重要基因，p53接受DNA损伤信号后表达增加，再通过p21基因以及细胞周期素D等，抑制CDK的激活，导致G₁期阻滞。大多数肿瘤细胞存在G₁期检查站点的基因突变(如p53、cyclinD)导致G₁期检查站点的功能缺陷^{[13, 14]}。本实验采用的人宫颈癌HeLa细胞是p53无功能的细胞，射线照射后只出现G₂期阻滞，而未出现G₁期阻滞，与文献报道一致^[13]。药物+照射组与单纯照射组比较，G₂期阻滞的比例下降，说明药物能部分去除射线导致的G₂期阻滞，受损细胞不能停留在G₂期修复而进入M期进行异常分裂，发生增殖性死亡。

DNA双链断裂是细胞致死的主要原因，当双链断裂积累至一定程度，凋亡相关基因被激活，并诱导凋亡发生。亦有报道显示，凋亡与SF₂密切相关，能预测肿瘤细胞放射敏感性大小^[15]。本实验通过流式细胞仪观察到药物+照射组与单纯照射组相比，细胞凋亡率明显增加，说明该药物能增加射线诱导的凋亡。

射线或化疗药物可诱导肿瘤细胞NF-κB活性升高，并调控介导放化疗耐受的一些基因的表达，抑制NF-κB的活性能增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性，NF-κB有望作为克服肿瘤细胞放化疗耐受的重要靶点^[16]。本实验中，单纯照射组与对照组相比，NF-κB活性升高约1.4倍，说明射线能激活HeLa细胞NF-κB的活性，与文献报道一致^[17]。药物组与对照组相比，NF-κB活性抑制约3.0倍；药物+照射组与单纯照射组相比，NF-κB活性抑制约3.6倍，说明CQ联合锌离子不仅抑制HeLa细胞基础的NF-κB活性，而且显著抑制射线诱导的NF-κB活性的升高。

本实验观察到CQ联合锌离子对HeLa细胞产生明显放射增敏效应，为宫颈癌临床放射增敏治疗提供一种新思路，其机制可能与药物抑制射线诱导的NF-κB活性升高和G₂期阻滞相关，关于NF-κB调控HeLa细胞放射增敏的具体分子机制尚不清楚，正在进一步研究之中。