神经营养因子受体(neurotrophin receptor p75 interacting MAGE homologue，NRAGE)，又称MAGED1或Dlxin-1，属于黑色素瘤相关抗原MAGE家族Ⅱ类，最初作为一个抑癌基因在细胞存活、凋亡、细胞周期和分化中发挥重要调节功能^[1]。近几年的研究发现，NRAGE在胃癌、黑色素瘤、结肠癌等癌组织中过表达，并存在与抑癌基因截然相反的作用^{[2, 3]}。本组前期研究发现，NRAGE在食管癌放射抗拒细胞TE13R120中表达升高^[4]，并提示NRAGE亚细胞定位改变可能促进食管癌放射抗拒细胞TE13R120放射抗性的形成^[5]。

上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)表现为上皮细胞失去细胞间的黏附性和极性，获得迁移特性，具有更强的侵袭和转移能力^[6]。目前已有多项研究证实EMT与放疗抗性的形成相关^[7]。Kumar 等^[2]发现在正常乳腺上皮细胞EMT期间NRAGE的亚细胞定位发生改变。但NRAGE亚细胞定位改变与EMT及食管癌细胞放射抗性形成存在何种机制尚无报道。本研究旨在进一步探讨食管癌细胞中NRAGE亚细胞定位改变在EMT与放射抗性形成中的作用。

1. 细胞系与材料:人食管鳞状细胞癌细胞系TE13为北京大学高献书教授实验室惠赠，TE13R120经反复照射，累积剂量120 Gy，并验证放射抗性稳定遗传后获得^[8]。两株细胞均置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基内，在37℃、5%CO₂饱和湿度的培养箱内培养。转化生长因子-β1(TGF-β1)和MAGED1多克隆抗体均购自美国Peprotech公司；E-钙黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；波形蛋白(Vimentin)多克隆抗体购自北京博奥森公司；DAB显色剂及一步法聚合物检测系统均购自北京中杉金桥公司；引物设计购自上海捷瑞公司；PrimeScript^TM Ⅱ反转录试剂盒与SYBR Premix Ex Taq^TM均购自日本TaKaRa公司。光学倒置显微镜及照相系统购自日本SANYO公司，Real-time PCR仪购自安捷伦科技有限公司，全数字引导直线加速器购自瑞典医科达公司。

2. TGF-β1诱导TE13细胞发生EMT建立EMT模型细胞：TE13细胞常规消化后接种适量细胞于6孔板中，在37℃、5%CO₂饱和湿度条件下培养过夜。无血清培养基饥饿培养6～8 h，加入TGF-β1(10 ng/ml)处理48 h后在相差显微镜下观察细胞形态变化并拍照。

3. Real-time PCR：取对数生长期的TE13细胞、TE13R120细胞和EMT模型细胞，利用Trizol试剂提取总RNA，NanoDrop2000测量检测RNA纯度和浓度，使A₂₆₀/A₂₈₀比值控制在1.8～2.0之间。Real-time PCR操作步骤按照TaKaRa说明书进行。采用GAPDH做内参对照，Real-time PCR引物序列为：GAPDH上游：5′CATGAGAAGTATGACAACAGCCT 3′，下游：5′ AGTCCTTCCACGATAC
CAAAGT 3′ ；E-cadherin 上游：5′ CAGCGTGTGTGACTGTGAAG 3′ ，下游：5′ AAACAGCAAGAGCAGCAGAA 3′ ；Vimentin上游：5′ CCTGCAGGATGAGATTCAGA 3′ ，下游：5′ GGCAGAGAAATCCTGCTCTC 3′ ；NRAGE上游：5′ TGCCAGTGAGGCTGTCCTCT 3′ ，下游：5′ CATCTGCAGCCTCCATGAACT 3′ 。

Real-time PCR反应体系为：95℃ 30 s 1个循环；95℃ 5 s，60℃ 20 s 40个循环；起始温度 60℃,目标温度 95℃。以上实验重复3次。

4．Western blot检测：细胞裂解液裂解同上3种细胞，4℃ 12 000×g离心10 min取上清，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，变性，-20℃储存。按每孔上样量30 μg进行SDS-PAGE电泳，90 V恒压转膜90 min，3%脱脂奶粉封闭1 h。一抗4℃孵育过夜(E-cadherin 1∶1 000，Vimentin 1∶1 000，MAGED1 1∶1 000)，用TBST在脱色摇床上洗膜15 min×3次，加辣根酶羊抗鼠(1∶2 000)或羊抗兔(1∶2 000)IgG，37℃孵育1 h后，用TBST洗膜5 min×3。ECL显色试剂盒显影。以上实验重复3次。

5．统计学处理：数据以 ± s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料两组间比较采用t检验，多组间的比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.TGF-β1诱导TE13细胞形态学变化观察：TE13细胞在TGF-β1处理48 h后，通过相差显微镜观察，未处理的TE13细胞呈不规则的多边形，细胞间边界不清，呈片状生长，细胞间结合紧密，表现为不规则的上皮细胞形态；经TGF-β1刺激后，大部分细胞呈纺锤形，细胞排列较乱，细胞间连接疏松，呈现明显的间质细胞形态(图 1)。

图 1(Figure 1)

Figure 1

图 1 TE13细胞未处理(A)和处理后(B)的形态学变化 ×200 Figure 1 Morphology of TE13 cells before (A) and after (B) TGF-β1 treatment ×200

2.TE13细胞、EMT模型细胞、TE13R120细胞上皮及间质标记蛋白表达的情况：经过TGF-β1处理48 h后，Real-time PCR和Western blot结果显示，细胞上皮标记蛋白E-cadherin的mRNA水平和总蛋白水平均下调，间质标记蛋白Vimentin的mRNA水平和总蛋白水平均上调，且差异有统计学意义(t=13.56、-232.84，P < 0.05，表 1，图 2)。表明TGF-β1诱导TE13发生EMT的细胞模型建立成功。Real-time PCR和Western blot结果显示，与亲本TE13细胞相比，TE13R120细胞中E-cadherin和Vimentin mRNA及总蛋白出现同EMT模型细胞相似的趋势，且差异具有统计学意义(t=15.84、-54.54，P < 0.05，表 1，图 2)。提示食管癌放射抗性细胞TE13R120已经具有的EMT样表型。

表 1(Table 1)

表 1 3组细胞中E-cadherin和Vimentin mRNA水平表达 Table 1 The mRNA expression of E-cadherin and Vimentin in three groups ( ± s) 细胞 样本数 E-cadherin Vimentin mRNA TE13 10 1.58±0.29 1.02±0.24 EMT 12 0.21±0.14a 22.85±0.21a TE13R120 8 0.09±0.05a 23.15±1.13a 注：与TE13细胞比较，a t=13.56、-232.84, 15.84、-54.54，P < 0.05

表 1 3组细胞中E-cadherin和Vimentin mRNA水平表达 Table 1 The mRNA expression of E-cadherin and Vimentin in three groups

图 2(Figure 1)

Figure 2

图 2 TE13细胞、EMT模型细胞和TE13R120细胞中E-cadherin及Vimentin 蛋白表达水平 Figure 2 The protein expressions of E-cadherin and vimentin in TE13 cells, EMT model cells and TE13R120 cells

3. NRAGE mRNA和总蛋白在TE13细胞、EMT模型细胞和TE13R120细胞中的表达：Real-time PCR结果显示,与TE13细胞相比，NRAGE在后两种细胞中mRNA水平的表达量均上调 (t=-8.73、-5.62，P < 0.05);Western blot检测结果显示，TE13R120细胞和EMT模型细胞NRAGE的总蛋白表达量较TE13细胞水平上调,见图 3。在TE13R120和EMT模型细胞中均发现NRAGE的过表达现象(t=-0.88，P>0.05)，提示食管癌放射抗性细胞极可能由于EMT的发生参与了NRAGE的过表达，进而促使放射抗性产生。

图 3(Figure 1)

Figure 3

注：a与TE13细胞同一基因比较，t=-8.73、-5.62，P < 0.05图 3 TE13细胞、EMT细胞模型及TE13R120细胞中NRAGE mRNA(A)和总蛋白(B)表达情况 Figure 3 Expressions of NRAGE mRNA (A)and its protein (B) in TE13 cells, EMT model cells and TE13R120 cells

4. NRAGE胞质胞核蛋白在TE13细胞、EMT模型细胞和TE13R120细胞中的表达：进一步检测其内胞质胞核表达情况，三者胞质蛋白NRAGE表达量无明显差别，而胞核蛋白NRAGE表达量TE13R120细胞和EMT模型细胞较TE13细胞明显增多，且TE13R120细胞和EMT模型细胞间没有差别(图 4)。提示，EMT的发生促使NRAGE亚细胞定位发生改变。

图 4(Figure 1)

Figure 4

图 4 TE13细胞、EMT细胞模型及TE13R120细胞中胞质蛋白(A)和胞核蛋白(B)表达情况 Figure 4 Expressions of NRAGE protein in cytoplasm (A) and nuclei (B) of TE13 cells, EMT model cells and TE13R120 cells

放射抗性是肿瘤放疗失败的主要原因，同时也是食管癌放射生物学研究的焦点，对其分子机制的研究备受关注。多项研究证实肿瘤细胞受照射后可发生EMT^[9]，并证实EMT可促进放射抗性的形成^[10]。而且在具有放射抗性的肿瘤细胞，如鼻咽癌、前列腺癌、食管癌等细胞中存在EMT样表型^{[11, 12]}。本实验在具有放射抗性的食管癌细胞TE13R120中发现并验证了EMT样表型的存在。

在本组的前期研究中，应用基因芯片技术分析了食管鳞状细胞癌细胞TE13与其建立的放射抗性细胞TE13R120的差异表达基因，发现NRAGE在TE13R120细胞中高表达，显示NRAGE的高表达与放射抗性相关^[5]，但NRAGE亚细胞定位参与放射抗性的分子机制尚无文献报道。在关于NRAGE与细胞黏附、侵袭转移方面的研究中，发现多种肿瘤细胞表现出EMT样表型^[13]，且有研究证实，在乳腺上皮细胞EMT形成期间NRAGE的表达发生改变，即核移位^[2]。就此猜测NRAGE、食管癌放射抗拒细胞、EMT三者间存在某种联系。

为研究NRAGE在EMT参与放射抗性的分子机制，本实验对3株细胞NRAGE的转录水平和翻译水平进行检测，结果显示，TGF-β1成功诱导TE13细胞发生EMT后，NRAGE在细胞核中的表达明显上调，且与同样具有EMT样表型的放射抗拒细胞TE13R120中NRAGE核表达变化相一致。可见EMT的发生可能通过参与NRAGE亚细胞定位改变，促进放射抗性的形成。但其发生的详细分子机制尚不清楚。有报道证实，过表达NRAGE可抑制上皮标记蛋白E-cadherin 和β-catenin的表达^[13]，E-cadherin的下调作为EMT形成过程中的标志性事件^[7]，可能通过NRAGE改变E-cadherin和β-catenin的表达参与EMT的形成，这种亚细胞定位的改变与EMT及放射抗性的形成是通过何种方式进行调控，仍需进一步研究。

近几年，有关NRAGE核移位的研究开始受到关注。Matsuda等^[14]研究发现NRAGE可以与Ror2的C端结合，共定位于近细胞膜，而Ror2表达下调或缺失时，NRAGE基因移位入细胞核，与Msx2结合，启动其转录活性。Kumar等^[2]发现锚定蛋白Ankyrin-G N端锚蛋白重复区域与E-cadherin结合，并将NRAGE定位于细胞质中，当上皮细胞发生EMT后，Ankyrin-G的表达受到抑制，可允许小部分NRAGE转移至细胞核。说明NRAGE的功能比较复杂，在细胞内有不同的定位，参与调控不同的信号通路，发挥不同的生物学功能，NRAGE的核移位可能赋予了NRAGE不同的角色。对于其亚细胞定位的改变机制，可从上述研究中寻找关键分子对NRAGE在细胞核和细胞质之间穿梭机制进一步探讨。

综上所述，本实验通过体外实验发现了NRAGE可能通过参与EMT促进放射抗性的形成的机制。本实验虽然为研究放射抗性形成发现了新的靶点，但仍有许多问题有待进一步研究，其中包括缺乏体内实验的验证；放射治疗如何提高细胞内NRAGE的表达量；NRAGE进入细胞核是否影响其他基因的转录。尽管如此，该发现在放射抗性的形成、EMT与放射抗性形成机制研究中提供了新的方向，对放射增敏药物的研发提供了新的靶点。