胶质母细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤。当前对胶质瘤普遍的治疗方法是手术切除，其次是辅助放疗^[1]。表皮生长因子受体(EGFR)在信号通路中发挥着调节细胞增殖、血管生成和肿瘤转移的关键作用^[2]。其广泛表达于包括乳腺癌、黑色素瘤、脑胶质母细胞瘤等几乎所有肿瘤细胞中，已成为抗癌治疗的一个有吸引力的靶点之一^[2]。20世纪80年代至今，已经有多种抗EGFR抗体和EGFR抑制剂应用于临床，如西妥昔单抗(C225)、马妥珠单抗(EMD7200)、吉非替尼等。研究表明，高剂量的放射性核素标记西妥昔单抗治疗局灶恶性头颈部肿瘤可以控制病灶，减少死亡率，降低药物不良反应^[3]。将放射性核素引入纳米载体，可以实现核素显像，将肿瘤的治疗及治疗后疗效评估结合起来，更有发展前景。本研究合成了¹³¹I标记的以C225为靶向性位点的纳米载体，在体内、体外实验中进行核素显像及胶质瘤的放射性核素纳米靶向治疗，探讨其靶向性杀伤肿瘤细胞的可行性和有效性。

1. 试剂：DMEM购自美国GIBCO公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；青链霉素、牛血清白蛋白(BSA)、聚己内酯(PCL)购自天津厚普生物技术开发有限公司；antiEGFR(西妥昔单抗，C225)购自德国默克公司；¹³¹I由北京原子高科股份有限公司提供；磷酸盐缓冲液(PB)、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、1%的过氯酸钠溶液等试剂为天津医科大学总医院核医学科实验室配置。

2. 细胞培养：人脑星形母细胞瘤细胞(U87)和人神经胶质细胞瘤细胞(U251)两种肿瘤细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，均为EGFR过表达细胞系。将细胞培养于含有10%FBS和1%青链霉素的DMEM培养基中，放置于5% CO₂，37℃的孵育箱中。

3.实验动物：BALB/c雌性裸鼠20只，4周龄，(13.15±0.61)g。购自中国人民解放军动物医学研究中心实验室，合格证号：0025231。裸鼠的饲养依据SPF级标准。

4.构建双亲性的BSA-PCL纳米载体：首先合成双亲性的BSA-PCL^{[4, 5]}。双亲性的BSA-PCL结合体是通过乳化溶剂蒸发的方法得到。在室温条件下，4 mg 的BSA-PCL结合体溶解于4 ml的PB中(0.1 mol/L，pH=7.4)，经10 min的超声乳化后制备产生；在超声乳化的过程中用注射器向PB溶液中加入2 ml的二氯甲烷，最后得到纯净的BSA-PCL纳米载体；靶向性西妥昔单抗标记的纳米载体亦是通过此方法得到。BSA-PCL和antiEGFR-BSA-PCL均需4℃保存，由天津大学高分子材料科学与工程系刘中云博士和常津教授合成提供。

5.¹³¹I标记纳米载体：氯胺T直接标记法是一种稳定的得到公认的标记方法^{[6, 7]}。相同体积的antiEGFR-BSA-PCL和BSA-PCL分别溶解于PB(0.1 mol/L，pH=7.4)溶液中至总体积为100 μl(1 mg/ml)，同时加入0.37～37 MBq的¹³¹I。总体积为100 μl的氯胺T(5 mg/ml溶解于PB)加入前述的¹³¹I与纳米载体的混合液中，振荡器振荡60～90 s，然后加入等体积100 μl(5 mg/ml溶解于PB)的偏重硫酸钠终止前述反应，置于振荡器上充分振荡60～90 s。最后使用超滤管(德国Merck Millipore公司)离心25 min，离心半径15 cm，5 000 r/min。测定标记率和放射化学纯度。

6.共聚焦显微镜观察细胞转染纳米载体：参照文献[8, 9, 10]。细胞培养如前所述，将细胞种植在共聚焦小皿(5×10³/皿)内。按照前述步骤向共聚焦小皿中分别加入antiEGFR-BSA-PCL或BSA-PCL(两种纳米载体均标记有荧光分子)，将小皿放置于5%CO₂，37℃的孵育箱中分别培养4和12 h。孵育结束后弃纳米载体，用无菌的PBS(0.1 mol/ml，pH=7.4)冲洗2～3次，0.5 ml多聚甲醛将细胞固定。用荧光共聚焦显微镜观察。

7. MTT细胞毒性实验分析：参照文献[11, 12, 13]。将U251和U87细胞分别种植于96孔板中，使得每孔的细胞量达到约1×10⁴细胞，¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL和¹³¹I-BSA-PCL分别按照相同的浓度梯度，等体积加入各孔中，培养4 h，弃掉每孔中的纳米载体，每孔加入20 μl(5.0 mg/ml)的四甲基偶氮唑盐(MTT，美国Sigma公司)溶液，温育4 h后，弃掉MTT，加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)充分振荡10 min后，将96孔板放置于酶标仪中492 nm波长的荧光下观察(每个浓度设置6个重复孔)。

8. 荷瘤裸鼠模型制备及瘤体积变化测定：参照文献[14, 15, 16, 17]。采用U87胶质瘤细胞皮下种植的方法建立荷瘤裸鼠模型。取50 μl U87细胞悬浮液(×10⁸细胞)用注射器缓慢注入裸鼠的背部皮下。继续饲养3～4周后，当种植瘤的直径达到1 cm左右时，将荷瘤裸鼠按照字母表随机分为4组，每组5只。分别于瘤体内注射200 μl的生理盐水(对照组)、74 MBq(均为370 MBq/ml) ¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL、¹³¹I-BSA-PCL和¹³¹I；并且于注药后4、24及96 h分别进行SPECT(Discovery VH,美国GE公司)显像。

注药后每隔3天测量并记录种植瘤体积变化以及裸鼠体重变化情况。为了减少裸鼠腮腺及甲状腺等部位摄取¹³¹I，所有的实验裸鼠在注射药物前的4 h经腹腔注射1%的过氯酸钠溶液，并且在注射药物后给予1%的过氯酸钠溶液饮水直至裸鼠死亡。

9. 统计学处理：所有的实验均重复3次。采用SPSS 15.0软件进行统计学处理。结果以 ± s的形式表示。单样本数据采用t检验分析，两个或两个以上的样本数据采用方差分析或者配对样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.antiEGFR-BSA-PCL和BSA-PCL的细胞结合及内吞：采用共聚焦显微镜分析细胞结合、内吞靶向性和非靶向性的纳米载体的情况。在两种细胞系中，荧光标记的antiEGFR-BSA-PCL组细胞表面的荧光强度高于荧光标记的BSA-PCL组，与细胞在两种荧光标记的纳米载体孵育时间无关，如图 1所示。antiEGFR-BSA-PCL组细胞表面及细胞内部的绿色荧光较BSA-PCL组多，表明标记有FITC的antiEGFR-BSA-PCL更容易连接到细胞表面，并且更容易被细胞内吞；BSA-PCL组4与12 h细胞表面及细胞内部绿色荧光的量无明显差异。

图 1(Figure 1)

Figure 1

图 1 共聚焦显微镜间接测量U251细胞(A)和U87细胞(B)与荧光标记的antiEGFR-BSA-PCL 和 BSA-PCL靶向结合活性 ×40 Figure 1 The binding ability of FITC-labeled EGFR-BSA-PCL and BSA-PCL to U251 and U87 cells detected by a confocal microscopy (×40) A. U251； B. U87

2.MTT细胞毒性试验分析细胞的生存率：采用氯胺T直接标记法对纳米载体进行¹³¹I标记，标记产物¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL和¹³¹I-BSA-PCL的标记率为80%～95%，放化纯约为98%。

MTT结果显示，加药后24、48、72、96 h，¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL和¹³¹I-BSA-PCL的放射性活度为0.925 MBq时，其对胶质瘤细胞生长的抑制率均达到最高。加药后培养U87和U251细胞24 h，其生存抑制率如表 1所示。当放射性纳米载体的放射性活度达到0.925 MBq时，U251和U87细胞的生长抑制率¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL组均高于¹³¹I-BSA-PCL组(t=2.517、2.821，P < 0.05)，且均高于同组其他剂量(U251：t=2.148、2.693，P < 0.05；U87：t=2.436、2.615，P < 0.05)。提示相同放射性活度的¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL较¹³¹I-BSA-PCL对胶质瘤细胞的生长有更强的抑制作用。而单纯的¹³¹I组对两种细胞生长抑制率很低，差异有统计学意义(F=82.42，P＜0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 不同药物活度对不同细胞各载体组作用24 h后细胞生长抑制率的影响 Table 1 The proliferation inhibition rate of radioactivity nanoparticles on U87 and U251 cells (%, ± s) 细胞 组别 样本数 0.370 MBq 0.925 MBq 1.850 MBq 2.775 MBq 3.700 MBq U87 131I-antiEGFR-BSA-PCL组 3 16.87±0.15 60.30±0.20a 56.80±0.10b 39.57±0.15 35.40±0.10 131I -BSA-PCL组 3 14.90±0.04 47.90±0.21 29.72±0.17b 22.27±0.21 25.55±0.13 131I组 3 1.23±0.15 1.49±0.01 3.00±0.15 2.27±0.15 1.90±0.10 F值 2.86 3.01 4.32 2.69 4.26 P值 0.02 0.03 0.03 0.02 0.04 U251 131I-antiEGFR-BSA-PCL组 3 15.10±0.15 64.31±0.13a 46.80±0.10b 35.57±0.15 25.40±0.10 131I -BSA-PCL组 3 15.07±0.15 48.10±0.10 29.00±0.10b 21.37±0.15 12.27±0.15 131I组 3 1.23±0.15 1.49±0.01 3.00±0.15 2.27±0.15 1.51±0.10 F值 3.14 2.19 3.69 1.87 3.85 P值 0.03 0.04 0.02 0.03 0.03 注：a与同一活度131I-BSA-PCL组比较，t=2.517、2.821，P < 0.05；b与同一细胞同一组别0.925 MBq 比较，t=2.436、2.615、2.148、2.693， P < 0.05

表 1 不同药物活度对不同细胞各载体组作用24 h后细胞生长抑制率的影响 Table 1 The proliferation inhibition rate of radioactivity nanoparticles on U87 and U251 cells

3.放射性纳米载体在裸鼠体内的生物学分布：¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL、¹³¹I-BSA-PCL和¹³¹I在荷瘤裸鼠体内的生物学分布如表 2所示。分别于注药后4、24和72 h处死荷瘤裸鼠并取其脏器组织。用γ-计数仪测定组织的放射性计数，分别于注药后4、24和96 h进行SPECT显像(图 2)，可知种植瘤部位的显影最清晰，随着时间的延长肿瘤组织部位的显影逐渐减淡，裸鼠其他部位的显影逐渐清晰，且¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL组药物在瘤体内滞留的时间较¹³¹I-BSA-PCL及¹³¹I长。肿瘤组织放射性计数与其他组织相比，在不同时间点均处于较高值，此后呈下降趋势，并且在不同的时间点，¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL组的放射性计数较¹³¹I-BSA-PCL组高，且下降速度慢，说明¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL在瘤体内停留的时间较长，当给药后24 h种植瘤内的单位质量放射性计数率达到最高，且24和72 h ¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL组明显高于¹³¹I-BSA-PCL组(t=2.273、1.965，P＜0.05)，见表 2。

图 2

Figure 2

图 2 注药后不同时间点各组荷瘤裸鼠全身SPECT显像结果 Figure 2 The SPECT images of nude mice after drug administration at different time points

表 2(Table 2)

表 2 给药后不同时间两组裸鼠各组织的单位质量摄碘率(×106计数·min-1·g-1, ± s) Table 2 The radioiodine uptake rate of 131I-antiEGFR-BSA-PCL and 131I-BSA-PCL in different tissues(×106 counts·min-1·g-1, ± s) 组别 给药后时间(h) 只数 肿瘤 心肌 肝脏 脾脏 131I-antiEGFR-BSA-PCL组 4 3 7.78±0.06 1.48±0.02 1.27±0.01 0.99±0.00 24 3 17.76±0.39a 1.69±0.01 1.82±0.01 1.10±0.01 72 3 1.83±0.11b 0.26±0.01 0.49±0.01 0.41±0.02 131I-BSA-PCL组 4 3 7.28±0.06 1.46±0.02 1.20±0.03 0.91±0.00 24 3 11.65±0.58 1.44±0.05 1.09±0.01 0.79±0.01 72 3 1.58±0.07 0.20±0.01 0.19±0.01 0.26±0.03 注：a与24 h肿瘤131I-BSA-PCL组比较 t=2.273, P＜0.05；b与72 h肿瘤131I-BSA-PCL组比较，t=1.965, P＜0.05

表 2 给药后不同时间两组裸鼠各组织的单位质量摄碘率(×106计数·min-1·g-1, ± s) Table 2 The radioiodine uptake rate of 131I-antiEGFR-BSA-PCL and 131I-BSA-PCL in different tissues(×106 counts·min-1·g-1, ± s)

4.不同种类放射性纳米载体对荷瘤裸鼠肿瘤的影响：¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL组裸鼠的种植瘤体积缩小较明显，且存活时间相对较长，而¹³¹I-BSA-PCL及¹³¹I组裸鼠的种植瘤体积变化及存活时间差异无统计学意义(P>0.05)。瘤体内注射药物后，随着肿瘤的生长，裸鼠出现恶液质甚至死亡，种植瘤出现溃疡、缺血坏死，测量结果误差较大，故表现出对照组或¹³¹I组种植瘤体积下降更明显的假象，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 注射药物后各组裸鼠肿瘤体积大小随时间延长的变化 Table 3 The changes of the tumor size after drug treatment (mm3, ± s) 组别 只数 0 d 3 d 6 d 9 d 12 d 15 d 对照组 5 957.23±42.34 957.23±42.34 957.23±42.34 836.06±51.14b 302.53±23.95b 0.00±0.00b 131I组 5 995.83±96.81 974.83±95.84 961.51±94.58 928.51±93.89b 560.27±45.84b 230.80±39.76b 131I-antiEGFR-BSA-PCL组 5 898.57±31.05 866.91±31.19 832.57±30.82a 754.23±28.78 751.57±29.09b 666.61±20.34b 131I-BSA-PCL组 5 995.83±96.81 970.17±95.43 948.17±94.73 859.17±43.11b 557.93±43.91b 272.77±47.44b 注：a与131I-BSA-PCL组比较， t=4.115， P<0.05。b治疗后9、12、15 d，各组裸鼠数量依次为3、4、4、1、2、4、3、0、1、3、2只

表 3 注射药物后各组裸鼠肿瘤体积大小随时间延长的变化 Table 3 The changes of the tumor size after drug treatment

在胶质瘤细胞中(40%～70%胶质瘤患者)有EGFR过表达或者表达活跃^{[18, 19]}。通常认为胶质瘤的治疗耐药性、胶质瘤患者的低生存率及预后差与EGFR的过表达相关^{[20, 21]}。利用胶质瘤细胞表面高表达EGFR的这一特性，将抗EGFR抗体连接到纳米载体表面，利用纳米载体复合物靶向性的连接到胶质瘤细胞表面，使得细胞表面连接的纳米载体的数量增加及纳米载体在细胞内的停留时间延长。目前使用的EGFR酪氨酸激酶抑制剂西妥昔单抗未发现严重的不良反应^[22]。细胞水平实验表明，连接有抗EGFR抗体的纳米载体能够很容易地靶向性连接到胶质瘤细胞表面，并且与细胞表面的结合效率很高。

MTT实验结果显示，¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL和¹³¹I-BSA-PCL两种纳米载体均可抑制U251和U87细胞的生长。当两种胶质瘤细胞在两种不同的纳米载体中孵育4 h后，¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL对细胞生长的抑制效率远高于¹³¹I-BSA-PCL；而且发现¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL和¹³¹I-BSA-PCL的放射性活度达到0.925 MBq时，在24、48、72及96 h时间点测量，纳米载体对细胞生长的抑制效率均达到最大值。

放射性碘摄取实验中，发现当¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL达到最大致死剂量后，随着¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL剂量的增加，其对细胞生长的抑制效率未见明显变化。在本研究中，两种纳米载体对胶质瘤细胞生长达到最大抑制率时的放射性活度为0.925 MBq。

实验结果中，当纳米载体的放射性活度达到0.925 MBq后，随着¹³¹I标记的纳米载体剂量的增加，其对胶质瘤细胞的生长抑制效率没有增加反而有下降的趋势，“顿抑现象”可能用于解释这一现象。顿抑现象通常在核素治疗中发生。顿抑现象定义为当¹³¹I的治疗剂量达到肿瘤细胞的最大致死剂量后，其对肿瘤细胞的杀伤作用并没有增加，反而效果会下降，这一现象通常在甲状腺细胞中比较常见^[23]。有研究表明，EGFR免疫反应阳性的肿瘤细胞对放射性治疗的反应效果差，这与肿瘤细胞表面表达EGFR水平有重要的关系^{[24, 25]}。一些胶质瘤细胞的辐射抵抗与其细胞表面高表达EGFR相关^[25]。然而，目前无法证明当¹³¹I标记的纳米载体达到最大致死剂量后，再增加¹³¹I标记的纳米载体的量是否能降低其对胶质瘤细胞生长的抑制作用。

本研究结果表明，可利用胶质瘤细胞表面高表达EGFR这一特性，用¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL治疗胶质瘤。核素标记的纳米载体代表了一种新的治疗、诊断方法，为大多数胶质瘤患者提供了新的治疗方案的选择，同时也为更深入的研究以及进一步改善预后提供了基础。

上述研究结果表明，¹³¹I-antiEGFR-BSA-PCL介导的放射性碘治疗在U251及U87细胞的细胞水平实验及动物水平实验中有显著效果。¹³¹I标记的连接有antiEGFR的纳米载体为脑胶质瘤的治疗提供了一种新的方法。