放射性肺损伤(RILI)是正常肺组织受到辐射后发生的非特异性炎症，是由多种细胞参与、多种细胞因子调控的复杂过程，同时，肺泡巨噬细胞水分子裂解产生氧自由基导致肺组织脂质过氧化损伤，并刺激成纤维细胞增生，形成肺纤维化^{[1, 2]}。还原型谷胱甘肽(GSH)是一种带有巯基的还原剂，可以通过减少氧自由基的含量而发挥治疗放射性损伤的作用^[3]，但是目前少见报道。本研究通过建立RILI小鼠肺损伤实验动物模型，运用GSH进行药物干预，研究GSH对RILI的影响作用，为临床放射治疗提供理论依据。

1. 主要试剂及仪器：注射用还原型谷胱甘肽钠(昆明积大制药股份有限公司)0.6 g/支规格。MMP-9、TIMP-1、IL-4和IL-6酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒由北京诚林生物科技公司分装。美国Varian23EX型6 MV医用直线加速器。酶标仪购自北京朗普科技科技有限公司。

2. 动物及分组：7～8周SPF级BALB/c小鼠100只，由青海大学医学院提供，健康雄性，合格证号：SCXK(青)2012-0011。体重(20±2)g，于光照明暗12 h交替、自由饮水、温度(23±2)℃、湿度适宜适应性饲养。2周后，按随机数字表法分为5组，每组20只，分别是健康对照组、单纯照射组(15和30 Gy组)和GSH干预组(15 Gy+GSH组和30 Gy+GSH组)。照射剂量参照王慧等^[4]研究，每组照射后不同时间再按随机数字表法分为4个亚组。

3. 建立RILI模型：每只小鼠在照射5 min前称重后腹腔注射0.5%戊巴比妥纳0.2 ml进行麻醉。GSH干预组于麻醉后2 min腹腔注射240 mg/ml的GSH 0.2 ml，用药剂量参照雷章等^[5]研究；单纯照射组进行同样操作，腹腔注射0.2 ml生理盐水作对照。小鼠麻醉后固定仰卧位，激光定位全胸部，设置1 cm×2 cm照射野，源皮距98 cm，15 Gy照射5 min，30 Gy照射10 min，吸收剂量率3 Gy/min。照射后同环境下饲养，并记录照射后小鼠的一般情况变化。

4. 收集样本：于照射前、照射后1、2和3周对每只小鼠称重、取血样。眼球采血收集于EP管中，离心半径7 cm，5 000 r/min离心10 min，取上清液，-80℃储存备用。左肺于10%中性甲醛中固定，行HE染色。

5. 脾脏指数：颈椎脱臼法处死小鼠，迅速解剖取脾脏，用滤纸吸干表面血液立即称重，计算脾脏指数[脾脏指数(%)=脾脏重量(g)/体重(g)×1 000×100%]。

6. 细胞因子检测：酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠血清MMP-9、TIMP-1、IL-4和IL-6指标浓度，严格按照试剂盒使用操作说明书进行，检测酶标仪在450 nm处的吸光度(A)值，回归分析法自动计算出各观察指标浓度(数据表达用稀释后的数据表示)。

7. 统计学处理：数据用x±s表示。采用SPSS 20.0软件进行统计分析，组间比较采用ANOVA分析，两两比较采用 LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1.小鼠受照后不同时间的体重：结果列于表 1。与健康对照组比较，单纯照射组小鼠体重增加速度明显降低，在照射后第2周降低更明显(F=23.50，P<0.05)；与照射前比较，各组小鼠体重都在不同程度增加，但照射组小鼠体重增加幅度低于健康对照组。15 Gy组与15 Gy+GSH组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠照射前后不同时间的体重变化Table 1 The weight of mice at different time intervals after irradiation (g, x±s) 组别 只数 照射前 照后1周 照后2周 照后3周 健康对照组 5 20.34±0.20 24.60±0.36 29.64±1.38 31.16±0.25 15 Gy组 5 20.34±0.40 24.26±0.55 26.53±0.98 a 30.92±0.92 15 Gy+GSH组 5 19.46±1.15 24.71±0.79 28.74±0.46 31.05±3.08 30 Gy组 5 20.28±0.81 23.91±0.53 25.14±0.67 a 29.31±2.72 30 Gy+GSH组 5 19.93±0.97 24.59±0.58 26.08±0.52 a 30.32±1.50 F 值 1.16 1.61 23.50 0.73 P 值 >0.05 >0.05 <0.05 >0.05 注：GSH. 还原型谷胱甘肽。 a与同一时间健康对照组比较，P <0.05

表 1 各组小鼠照射前后不同时间的体重变化 Table 1 The weight of mice at different time intervals after irradiation

2. 小鼠受照后不同时间的脾脏指数：结果列于表 2。与健康对照组比较，小鼠脾脏指数在单纯照射后1周内急速下降(P<0.05)，随后慢慢上升，与照射前比较，差异有统计学意义(F=99.65，P<0.05)。使用GSH后能有效提高脾脏指数，GSH干预组与单纯照射组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠照射前后不同时间的脾脏指数Table 2 The spleen index of mice at different time intervals after irradiation (%, x±s) 组别 只数 照射前 照后1周 照后2周 照后3周 F 值 P 值 健康对照组 5 5.82±0.18 4.89±0.24 b 4.78±0.29 b 5.09±0.42 b 12.47 <0.05 15 Gy组 5 6.24±0.30 2.64±0.20 ab 3.69±0.43 ab 4.08±0.38 ab 99.65 <0.05 15 Gy+GSH组 5 5.98±0.36 3.83±0.43 ab 3.81±0.10 ab 4.61±0.35 b 88.25 <0.05 30 Gy组 5 6.12±0.20 3.11±0.30 ab 3.74±0.15 ab 4.65±0.66 b 58.96 <0.05 30 Gy+GSH组 5 6.21±0.19 4.07±0.53 ab 3.86±0.26 ab 5.28±0.56 b 34.98 <0.05 F 值 2.29 29.84 13.91 4.61 P 值 >0.05 <0.05 <0.05 <0.05 注：GSH. 还原型谷胱甘肽。 a与同一时间健康对照比较，P <0.05； b与同一组别照射前比较，P <0.05

表 2 各组小鼠照射前后不同时间的脾脏指数 Table 2 The spleen index of mice at different time intervals after irradiation

3. 建立小鼠RILI实验模型:健康对照组小鼠肺组织结构清晰、完整，无炎性细胞渗出、浸润，15 Gy照后能见少量的炎性细胞渗出、浸润，有部分肺泡破坏，但30 Gy照后能见明显的炎性细胞浸润、渗出，并且照后3周出现了肺纤维化，成功建立小鼠RILI实验模型。

4. 小鼠受照后不同时间的血清MMP-9表达：结果列于表 3。由表 3可知，照射后不同时间小鼠血清MMP-9表达不同，与健康对照组比较，差异有统计学意义(F=81.27、15.63、3.34，P<0.05)；随着照射后时间的延长，MMP-9表达量先上升后下降，照射后1周上升达高峰，与照射前比较差异有统计学意义(F=52.22、70.00，P<0.05)。在GSH保护下，与单纯照射组比较，15 Gy照射时能明显降低MMP-9表达。

表 3(Table 3)

表 3 各组小鼠照射前后不同时间的血清MMP-9表达Table 3 The MMP-9 level in the mouse blood serum at different time intervals after irradiation (μg/L, x±s) 组别 只数 照射前 照后1周 照后2周 照后3周 F 值 P 值 健康对照组 5 22.27±1.10 22.80±0.37 22.01±0.52 22.42±0.77 0.00 >0.05 15 Gy组 5 21.62±0.88 28.28±1.46 ab 23.16±0.76 b 21.45±0.88 52.22 <0.05 15 Gy+GSH组 5 22.29±1.62 27.02±0.77 ab 21.93±0.94 23.42±1.08 a 20.53 <0.05 30 Gy组 5 21.70±1.42 32.18±1.16 ab 26.76±1.47 ab 23.08±0.86 70.00 <0.05 30 Gy+GSH组 5 22.27±1.34 30.95±1.09 a 23.83±1.51 a 23.09±1.15 2.16 >0.05 F 值 1.21 81.27 15.63 3.34 P 值 >0.05 <0.05 <0.05 <0.05 注：GSH. 还原型谷胱甘肽。 a与同一时间健康对照组比较，P <0.05； b与同一组别照射前比较，P <0.05

表 3 各组小鼠照射前后不同时间的血清MMP-9表达 Table 3 The MMP-9 level in the mouse blood serum at different time intervals after irradiation

5. 小鼠受照后不同时间的血清TIMP-1表达：结果列于表 4。由表 4可知，不同照射剂量下，与健康对照组比较，小鼠TIMP-1表达量差异有统计学意义(P<0.05)；与15 Gy组照射比较，30 Gy组TIMP-1表达量下降(P<0.05)；照射后时间越长，TIMP-1表达量越高(F=138.96，P<0.05)。使用GSH后，TIMP-1表达量较单纯照射组增加(P<0.05)。

表 4(Table 4)

表 4 各组小鼠照射前后不同时间的血清TIMP-1表达Table 4 The TIMP-1 level in the mouse blood serum at different time intervals after irradiation (μg/L, x±s) 组别 只数 照射前 照后1周 照后2周 照后3周 F 值 P 值 健康对照组 5 20.92±1.36 20.26±0.43 19.99±0.16 20.11±1.05 1.07 >0.05 15 Gy组 5 20.26±1.18 14.48±1.28 ab 26.96±1.73 ab 31.39±1.39 ab 138.96 <0.05 15 Gy+GSH组 5 20.18±1.27 18.28±0.78 a 19.93±1.52 33.16±4.78 ab 34.66 <0.05 30 Gy组 5 20.03±1.23 11.99±1.28 ab 20.77±1.59 37.87±2.28 ab 218.22 <0.05 30 Gy+GSH组 5 20.01±1.69 12.31±1.53 ab 22.09±2.01 a 29.61±2.15 ab 72.93 <0.05 F 值 0.37 52.59 18.10 29.87 P 值 >0.05 <0.05 <0.05 <0.05 注：GSH. 还原型谷胱甘肽。 a与同一时间健康对照组比较，P <0.05； b与同一组别照射前比较， P <0.05

表 4 各组小鼠照射前后不同时间的血清TIMP-1表达 Table 4 The TIMP-1 level in the mouse blood serum at different time intervals after irradiation

6. 小鼠受照后不同时间的血清IL-4表达：结果列于表 5。由表 5可知，不同照射方式下，照射剂量越高，IL-4表达越少，与健康对照组比较，差异有统计学意义(F=9.72，P<0.05)；在单纯照射后第1周，IL-4表达量急速下降，随后慢慢上升，但高剂量照射下上升速度较慢，与照射前比较，差异有统计学意义(F=12.66，P<0.05)，第3周后仍明显低于健康对照组(P<0.05)。使用GSH后，IL-4表达量较单纯照射组均上升，但仅在高剂量照射1周后与健康对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 5(Table 5)

表 5 小鼠照射后不同时间的血清IL-4表达Table 5 The IL-4 level in the mouse blood serum at different time intervals after irradiation (μg/L, x±s) 组别 只数 照射前 照后1周 照后2周 照后3周 F 值 P 值 健康对照组 5 7.17±0.52 6.73±0.41 7.22±0.73 7.17±1.33 0.40 >0.05 15 Gy组 5 7.35±0.58 5.95±0.73 b 4.87±0.82 ab 6.89±1.14 8.48 <0.05 15 Gy+GSH组 5 7.86±0.31 7.25±0.47 6.86±1.72 7.29±1.61 0.58 >0.05 30 Gy组 5 7.80±0.79 4.04±1.24 ab 4.44±1.09 ab 4.67±1.17 ab 12.66 <0.05 30 Gy+GSH组 5 7.38±0.28 5.38±1.26 ab 6.69±1.09 6.37±0.73 4.09 <0.05 F 值 1.44 9.72 6.14 3.79 P 值 >0.05 <0.05 <0.05 <0.05 注：GSH. 还原型谷胱甘肽。 a与同一时间健康对照组比较，P <0.05； b与同一组别照射前比较，P <0.05

表 5 小鼠照射后不同时间的血清IL-4表达 Table 5 The IL-4 level in the mouse blood serum at different time intervals after irradiation

7.小鼠受照后不同时间的血清IL-6表达：结果列于表 6。由表 6可知，小鼠IL-6表达量随照射剂量升高而增加，与同一时间健康对照组比较，差异有统计学意义(F=10.86，P<0.05)；随着照射时间的推移，IL-6表达量一直上升，与照射前比较，差异有统计学意义(F=7.73、26.59，P<0.05)。使用GSH后，与单纯照射组比较，照后时间越长，IL-6表达量下降越明显(P<0.05)。

表 6(Table 6)

表 6 各组小鼠照射后不同时间的血清IL-6表达Table 6 The IL-6 level in the mouse blood serum at different time intervals after irradiation (μg/L, x±s) 组别 只数 照射前 照后1周 照后2周 照后3周 F 值 P 值 健康对照组 5 7.26±1.05 7.82±1.68 7.91±1.76 8.34±1.11 0.48 >0.05 15 Gy组 5 8.27±1.25 10.93±1.42 a 15.29±3.70 ab 17.92±2.60 ab 7.73 <0.05 15 Gy+GSH组 5 8.42±0.54 9.62±2.03 10.47±2.21 12.39±1.80 ab 4.47 <0.05 30 Gy组 5 8.04±1.76 15.80±3.03 ab 18.34±3.54 ab 23.36±2.43 ab 26.59 <0.05 30 Gy+GSH组 5 7.53±1.44 14.40±2.68 ab 14.55±1.34 ab 19.67±3.80 ab 19.45 <0.05 F 值 0.74 10.86 11.80 35.35 P 值 >0.05 <0.05 <0.05 <0.05 注：GSH. 还原型谷胱甘肽。 a与同一时间健康对照组比较，P <0.05； b与同一组别照射前比较，P <0.05

表 6 各组小鼠照射后不同时间的血清IL-6表达 Table 6 The IL-6 level in the mouse blood serum at different time intervals after irradiation

RILI的研究开始于20世纪20年代，近年来细胞因子在RILI发生中作用越来越受重视，可作为预测放射性纤维化发生的早期重要的生物标记物^[6]。细胞因子是由效应细胞分泌的细胞外信号蛋白，主要作用是修饰邻近细胞的行为，随着分子生物学技术的发展，研究发现电离辐射可引起肺内效应细胞产生释放多种细胞因子，启动成纤维细胞的增殖分裂，导致胶原蛋白的大量合成，最终形成肺间质的胶原沉积，进而发生肺组织的纤维化^[7]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类结构上依赖锌、钙离子的蛋白酶家族，几乎能降解所有细胞外基质成分，由于参与了肿瘤转移^[8]、慢性支气管炎^[9]、慢性阻塞性肺病(COPD)^[10]、冠状动脉硬化^[11]等多种纤维化疾病的病理过程，其在肺纤维化发生中的作用更引起人们的重视。目前发现，多种细胞因子在RILI中表达不同，Susskind等^[12]报道了肺癌、乳腺癌患者放疗后血浆中MMP-9升高。射线可刺激Ⅳ型胶原、肺组织MMP-9和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1的表达，但随照射后时间的延长呈现不同的变化趋势，它们之间的相互制约导致了RILI早期的组织重建，与后来形成的肺纤维化有必然的内在联系。白细胞介素(IL)是一类介导T、B细胞免疫调节作用的增殖细胞因子，Ghebremariam等^[13]发现，IL-6在放射性肺炎中有着重要的免疫调节作用，并且关系密切；Chung等^[14]发现，IL-4在小鼠肺组织受照射后的多个时间点中含量相似，变化不大，但与RILI存在密切关系。

细胞因子作为生物效应调节因子，成为学术界的关注热点。本研究发现，随着照射后时间的延长，小鼠成长、体重增加，单纯照射情况下，与健康对照组比较，小鼠体重增加速度明显下降，然而，小鼠脾脏指数却是先急速下降1周后慢慢上升，但照射3周后还是低于健康对照组，说明脾脏重量增加速度低于体重，辐射对小鼠免疫系统先抑制，后慢慢恢复作用，脾脏增生，免疫增强。从肺组织切片发现，单纯照射明显比健康对照组小鼠肺结构炎性细胞浸润，肺泡出血严重，并且照射剂量越高，损伤越严重，甚至形成肺纤维化，说明RILI实验小鼠模型建造成功。作为RILI的细胞因子标记物，MMP-9和TIMP-1有着相反的标记作用，小鼠因受到辐射损伤作用后，MMP-9很快升高，此后慢慢下降；但TIMP-1却相反，损伤作用使得MMP-9降解细胞外基质(ECM)，肺组织结构受到破坏，但由于小鼠损伤修复作用，TIMP-1发挥抑制作用，ECM得到修复。小鼠IL-4表达第1周内先急速下降，后有所上升，但不明显；而IL-6却是一直上升，作为免疫调节因子，发挥了重要作用。随着照射剂量的增加，放射损伤作用更严重，30 Gy照射下明显比15 Gy小鼠放射反应重，MMP-9、TIMP-1、IL-4和IL-6的变化均较15 Gy大。

目前，国内外已有许多放射损伤相关研究。周睿卿等^[15]用不同剂量X射线照射发现低于致死剂量的X射线照射可使小鼠血清IL-6等细胞因子浓度升高。韩秀文等^[16]通过5.5 Gy γ射线全身照射发现可引起骨髓造血抑制，同时导致IL-4等Th2细胞因子功能失调，而引起免疫异常。Lee等^[17]研究发现，克拉霉素可以减轻小鼠RILI。GSH是谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽物质，含有的巯基(-SH)是其发挥主要功能的基团，通过清除自由基而发挥细胞内自然的抗氧化作用^[18]。本研究发现，使用GSH后，小鼠的免疫功能明显较单纯照射组提高，放射损伤减轻，不管是高剂量还是低剂量照射，小鼠的恢复能力均较单纯照射组明显，但是在30 Gy时，保护作用比15 Gy低。由于本实验采用单次腹腔注射240 mg/ml 的GSH 0.2 ml，相对药代动力学而言不够完整，机体很容易将GSH代谢完，随着体内GSH被消耗，保护作用并没有维持很长时间。表现出小鼠恢复能力在下降^[19]，若要获得长效的抗放射损伤作用，应该长时间运用GSH并密切监测其不良反应。

RILI包括早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纤维化，是胸部肿瘤放射治疗后出现的严重并发症，目前还没有有效的处理措施，不仅妨碍放射治疗效果，还严重影响患者的生存质量。因此，预防比治疗更为重要^[20]。本研究仅研究了MMP-9、TIMP-1、IL-4和IL-6在RILI的作用，其发生机制有待于进一步研究。尽管如今很多研究者都在寻找有效的降低RILI的方法，但从放射物理角度，单纯缩小放射野和降低剂量已经不可能实施。研究发现，高迁移率簇蛋白1(HMGB1)在放射后炎症中发挥重要作用，可以促进炎症细胞活化、增生、分泌^[21]，其表达存在时间依赖性^[22]，通过抑制HMGB1表达，有效降低氧自由基含量，是降低RILI的重要途径。Wang等^[23]预测，抑制HMGB1可能可以预防RILI的发生。但如何通过GSH来抑制患者HMGB1表达，还有待进一步研究。