放射性脑损伤是在射线用于临床诊断和治疗过程中，由射线诊疗引发的神经系统损伤。研究发现，射线照射可引起调节认知功能和空间学习记忆的“中心核团”海马区齿状回神经干细胞的损伤和凋亡^[1]。针灸被证实可以改善脑的代谢，降低自由基，调节神经元^{[2, 3]}。本实验观察X射线照射对成年小鼠的脑损伤效应，以及电针百会、风府和双侧肾俞穴位对其认知功能和学习记忆能力的影响，从中医角度探寻脑辐射损伤的有效治疗方法。

1. 实验动物及分组：选用健康清洁级的30 d龄C57BL/6J小鼠100只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物合格证号No.11400700063049)。置于7∶00—19∶00光照、19∶00—7∶00黑暗的实验室中，饮食不限。饲养1周后，按随机数字表法分为对照组、射线照射模型组(4、8和16 Gy，简称模型组)、电针非穴位+射线照射组(4、8和16 Gy，简称电针非穴位组)、电针穴位+射线照射组(4、8和16 Gy，简称电针穴位组)，每组10只。

2. 实验仪器及试剂：全自动旷场实验设备、全自动Morris水迷宫(淮北正华生物仪器设备有限公司)；电针仪(上海华谊医用仪器有限公司G6805-2A型)。

3. 模型制备：参照文献[4]，适应饲养1周后开始建立放射性脑辐射损伤模型。小鼠俯卧位固定于放有聚乙烯膜的照射台上，左侧大脑半球照射范围为1 cm×2 cm，采用Primus型高能医用电子直线加速器(德国西门子公司)产生的X射线进行照射，源皮距(SSD)99.5 cm，照射剂量依据分组要求分别一次性照射4、8和16 Gy，照射剂量率为40 cGy/min。小鼠头颅覆盖1 cm厚度的遮盖物，以保证射线进入脑组织的剂量平均，脑组织接受照射剂量的变异为±5%。受照后小鼠被送回笼中，于第2天开始电针刺激。

4. 电针方法：电针穴位组，取百会：顶骨正中，风府，即枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷处；肾俞，即第2腰椎后两旁凹陷处^[5]。取回路1(百会，风府)、回路2(双侧肾俞)以无菌针灸针(苏州医疗用品厂0.30 mm×13 mm)向后斜刺入，针深1 mm左右，连接电针仪，设置电压1.5 V，频率10 Hz，波宽1 ms，针刺30 min/次，1次/d，连续针刺3个疗程(3周)。电针非穴位组，取非穴位1，即尾根前0.5 cm，后背正中线旁开0.3 cm；非穴位2，即尾根前1.0 cm，后背正中线旁开0.3 cm。取回路1(左侧非穴位1，非穴位2)、回路2(右侧非穴位1，非穴位2)。针刺方法同上。

5. 体重测定：观察各组小鼠的精神和体重。每只小鼠于造模第1、7和14天分别称体重。

6. 旷场实验：将小鼠单个放入敞箱(60 cm×60 cm×50 cm，底部为定面积的25格，内壁为黑色)记录5 min内其穿越格数为水平得分，后肢站立次数为垂直得分，修饰次数。每次实验完用75%乙醇擦拭敞箱，再进行下一只实验，用动物轨迹分析软件(Panlab Smar TBS)记录分析。连续测试4 d，取平均值进行统计。

7. Morris水迷宫实验：Morris水迷宫仪为直径160 cm、高50 cm的圆形水池，水池内壁漆为黑色，池内水深30 cm，水温保持在(22±2)℃，房间内光线恒定，水池周围竖起不透光围帘，无光线直射入水池内。水池壁上4个等距离点将水池分为4个象限，将第3象限设为靶象限，在靶象限距离池壁40 cm处放置一直径10 cm的透明平台，平台高28 cm，位于水面下2 cm处。水迷宫上方安置摄像机，与电脑主机相连，可同步记录小鼠运行轨迹。

定位航行实验：实验训练连续进行3 d，每天1次，将受试小鼠按顺时针方向依次由E、S、W、N 4个入水点分别放入水中，记录小鼠在2 min内从找到水下平台所需时间(即潜伏期)。如果在2 min内未找到平台，由实验人员将其引至平台并停留10 s。

空间探索实验：定位航行实验结束后，撤去平台，从同一入水点将小鼠放入水中，记录其在2 min内穿越原平台的次数和在原平台所在象限停留时间。

8. 统计学处理：数据用x±s 表示。采用SPSS 15.0软件进行分析。组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1. 各组小鼠体重变化比较：结果列于表 1。造模第1天，各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。随实验进行，与对照组相比，第7、14天检测模型组(受照8和16 Gy)小鼠体重显著下降(t=2.917、9.650、3.043、2.882,P<0.05)。与模型组(8和16 Gy)比较，第7、14天电针穴位组(8和16 Gy)小鼠体重显著减少(t=6.602、5.409、19.660、2.975,P<0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 不同剂量射线照射对各组小鼠体重的影响Table 1 Effect of different doses of radiation on the weight of mice (g,x±s) 组别 只数 第1天 第7天 第14天 对照组 10 22.28±0.55 23.22±0.54 24.04±0.56 模型组 4 Gy 10 22.25±0.52 22.30±0.63 23.16±0.56 8 Gy 10 22.15±0.23 21.53±0.21 a 22.22±0.21 a 16 Gy 10 22.15±0.33 17.01±0.35 a 17.47±2.01 a 电针非穴位组   4 Gy 10 21.63±0.77 22.67±0.33 23.38±0.37   8 Gy 10 23.11±0.35 24.00±0.38 24.32±0.50   16 Gy) 10 22.92±0.40 23.32±0.79 23.27±0.29 电针穴位组   4 Gy 10 22.74±0.31 22.10±0.11 24.27±0.46   8 Gy 10 22.62±0.32 24.63±0.42 b 24.07±0.27 b   16 Gy 10 23.01±0.51 24.35±0.13 b 24.11±0.31 b 注：a与对照组比较，t=2.917、9.650、3.043、2.882, P<0.05;b与同剂量模型组比较,t=6.602、5.409、19.660、2.975,P<0.05

表 1 不同剂量射线照射对各组小鼠体重的影响 Table 1 Effect of different doses of radiation on the weight of mice

2. 各组小鼠旷场实验比较：结果列于表 2。由表 2可知，与对照组比较，射线照射模型组(4 Gy)、电针穴位组(4 Gy)、电针非穴位组(4 Gy)垂直运动、水平运动、修饰次数差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组(8和16 Gy)垂直运动次数和水平 运动次数均显著降低(t=2.183、2.119、2.369、 2.231，P<0.05)，修饰次数降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组(8 Gy)和电针非穴位组(8 Gy)比较，电针穴位组(8 Gy)水平运动、修饰次数和垂直运动次数均显著增加(与模型组比较：t=8.914、4.325、2.727，P<0.05；与电针非穴位比较：t=4.030、3.014、2.150,P<0.05)。与模型组(16 Gy)和电针非穴位组(16 Gy)比较，电针穴位组(16 Gy)垂直运动次数显著增加(t=4.178、4.771，P<0.05)，其水平运动与修饰次数增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 不同剂量射线照射对各组小鼠认知功能的影响Table 2 Effect of different doses of radiation on cognitive function of mice (x±s) 组别 只数 水平运动(s) 修饰次数 垂直运动(s) 对照组 10 80.40±7.51 17.50±1.65 36.60±5.20 模型组 4 Gy 10 76.00±7.50 16.00±2.08 36.00±5.85 8 Gy 10 62.57±6.21 a 14.29±1.92 23.57±1.79 a 16 Gy 10 60.00±6.02 a 13.67±1.66 24.33±6.56 a 电针非穴位组   4 Gy 10 79.00±9.29 14.00±2.88 34.00±6.50   8 Gy 10 81.00±14.51 11.33±0.83 27.83±2.65   16 Gy) 10 68.61±22.83 13.35±1.20 24.33±1.22 电针穴位组   4 Gy 10 82.75±1.26 15.00±2.16 36.50±3.77   8 Gy 10 103.31±3.21 bc 18.23±1.67 b c 37.08±2.56 bc   16 Gy 10 79.33±6.82 15.33±2.60 35.67±2.04 bc 注： a与对照组比较， t=2.183、2.119、2.369、2.231, P<0.05； b与同剂量模型组比较： t=8.914、2.727、4.325、4.178, P<0.05; c与同剂量电针非穴位组比较： t=4.030、3.014、2.150、4.771, P<0.05

表 2 不同剂量射线照射对各组小鼠认知功能的影响 Table 2 Effect of different doses of radiation on cognitive function of mice

3. 各组小鼠水迷宫实验比较

(1)航行实验结果：列于表 3。由表 3可知，随着训练次数的增加，各组小鼠的潜伏期均不同程度缩短。与对照组比较，模型组(4 Gy)小鼠在第3天潜伏期明显增加(t=4.544，P<0.05)。与模型组和电针非穴位组分别比较，电针穴位组(4 Gy)小鼠在第3天潜伏期显著缩短(t=2.877、3.001，P<0.05)。与对照组比较，模型组(8和16 Gy)小鼠在第2、3天潜伏期均明显增加(t=2.544、3.706、3.796、7.934，P<0.05)。与模型组(8和16 Gy)和电针非穴位组(8和16 Gy)比较，电针穴位组(8和16 Gy)小鼠潜伏期在第2、3天均显著缩短(与模型组比较：t=5.404、7.869、4.104、15.590, P<0.05; 与电针非穴位组比较：t=2.938、7.955、6.566、10.350, P<0.05)。

表 3(Table 3)

表 3 不同剂量射线照射对各组小鼠潜伏期的影响Table 3 Effect of different doses of radiation on latent period of mice (x±s) 组别 只数 第1天 第2天 第3天 对照组 10 65.86±4.38 38.06±6.65 15.60±5.20 模型组   4 Gy 10 85.00±2.50 51.00±2.08 45.00±3.85 a   8 Gy 10 70.10±2.62 54.30±2.97 a 41.58±4.45 a   16 Gy 10 72.75±2.73 61.73±2.98 a 58.98±1.69 a 电针非穴位组   4 Gy 10 79.00±4.29 50.92±2.88 44.94±3.50   8 Gy 10 57.00±1.41 42.74±4.78 45.42±1.83   16 Gy 10 57.75±3.50 59.33±2.28 54.25±3.21 电针穴位组   4 Gy 10 81.75±1.26 35.08±2.16 29.50±3.77 bc   8 Gy 10 61.75±5.42 22.03±5.18 bc 17.43±3.85 bc   16 Gy 10 49.00±4.56 19.98±4.39 bc 12.33±2.47 bc 注： a与对照组比较， t=2.544、3.706、4.544、3.796、7.934, P<0.05 ； b与同剂量模型组比较： t=5.404、7.869、2.877、4.104、15.590, P<0.05; c与同剂量电针非穴位组比较： t=2.938、7.955、3.001、6.566、10.350, P<0.05

表 3 不同剂量射线照射对各组小鼠潜伏期的影响 Table 3 Effect of different doses of radiation on latent period of mice

(2)空间探索实验结果：列于表 4。在巡航定位实验中，与对照组比较，模型组(4、8和16 Gy)小鼠的穿越平台次数均显著减少(t=3.422、2.120、2.393，P<0.05)，并且模型组(8 Gy)小鼠在目的象限停留时间显著缩短(t=2.543, P<0.05)。与模型组比较，电针穴位组(4 Gy)小鼠穿越平台次数显著增加(t=2.446,P<0.05)。与模型组和电针非穴位组比较，电针穴位组(8 Gy)小鼠穿越平台次数和在靶象限停留时间均显著增加(t=2.673、2.613、3.345、2.179，P<0.05)。

表 4(Table 4)

表 4 不同剂量射线照射对各组小鼠空间探索的影响Table 4 Effect of different doses of radiation on spatial exploration behavior of mice (x±s) 组别 只数 穿越次数 停留时间(s) 对照组 10 7.00±1.38 50.17±3.54 模型组   4 Gy 10 2.25±0.15 a 40.76±5.53   8 Gy 10 3.71±0.71 a 34.38±8.10 a   16 Gy 10 3.67±0.18 a 33.80±7.06 电针非穴位组   4 Gy 10 4.33±0.66 44.83±3.12   8 Gy 10 2.33±0.98 35.58±6.40   16 Gy 10 2.67±0.54 38.30±1.83 电针穴位组   4 Gy 10 5.50±1.32 b 47.80±6.26   8 Gy 10 6.67±0.85 bc 53.96±5.49 bc   16 Gy 10 5.93±1.85 45.13±4.09 注： a与同指标对照组比较， t=3.422、2.120、2.393、2.543, P<0.05； b与同指标模型组比较， t=2.446、2.673、2.613, P<0.05； c与同指标电针非穴位组比较， t=3.345、2.179, P<0.05

表 4 不同剂量射线照射对各组小鼠空间探索的影响 Table 4 Effect of different doses of radiation on spatial exploration behavior of mice

放射性脑损伤是神经系统肿瘤放疗后的并发症之一，严重危害人类的健康，降低患者的生活质量，目前尚无有效的防治措施^[6]。放射性脑损伤主要表现为严重的神经功能障碍，如学习能力及记忆力的下降，甚至出现痴呆、癫痫发作等^{[7, 8]}。有文献报道，该病的发病机制与射线照射引起脑水肿，造成脑细胞缺血缺氧进而坏死、凋亡有关^{[9, 10]}。射线照射所致的脑损伤以认知障碍和学习记忆障碍为主要特征，因此，本实验采用旷场实验和Morris水迷宫对模型小鼠进行检测，并评价电针对小鼠学习记忆能力的影响。旷场试验是目前常用的一种动物行为学试验方法，用于研究实验对象在新环境中自发活动与探究行为，评价其在新环境中的认知能力和适应性。Morris水迷宫是英国心理学家Morris^[11] 于20世纪80年代设计的可应用于空间学习记忆研究的行为学实验方法。空间学习记忆是指通过检测实验对象空间方向、结构应用和反应时间等能力，评价其认知水平以及有关场景和事件的一种学习记忆能力^[12]。目前国内外广泛应用于检测和评价实验动物学习记忆能力。

中医中药作为中国传统医学的治疗方法，在脑损伤的康复治疗方面有着不可替代的作用，并且被世界卫生组织认可成为治疗脑损伤的辅助措施。放射性脑损伤属于中医学“中风”“头痛”“眩晕”等范畴。多为清阳不升，浊阴不降，气机逆乱，神明皆累而致气血不得正常流布，脑神失养，从而出现精神失常等种种表现。有研究表明，针刺对射线治疗导致的神经功能损伤具有显著的改善作用^{[13, 14]}。因此，本实验选取以督脉为主，以百会、风府配以足太阳经的肾俞(双侧)组成针灸处方来检测其对模型组认知功能和空间学习记忆的影响。上述3穴可相互联系，相互为用，起到健脑开窍，醒神益智的功效，从而达到防治放射性脑损伤的目的。

本实验选用不同剂量(4、8和16 Gy)制备放射性脑损伤模型，观察电针百会、风府和双侧肾俞穴位对模型小鼠认知能力及空间学习记忆能力的影响。已有实验研究发现，单次射线照射对大鼠空间学习记忆能力、血脑屏障以及海马区神经元增殖具有损伤作用，而电针干预可一定程度改善损伤^{[15, 16]}。本研究表明，射线照射严重损伤小鼠认知能力和空间学习记忆能力。其中在第7、14天检测发现，与对照组比较，模型组小鼠体重明显减轻。结果提示，接受射线照射小鼠虽然与对照组有同样的饲养条件(食物和水)，但由于射线对中枢以及躯体的双重作用，使其体重显著下降。在旷场实验中，与对照组比较，模型组小鼠水平运动及垂直运动均显著下降，修饰次数明显减少。而与模型组和电针非穴位组比较，电针穴位组小鼠的水平运动、垂直运动和穿越次数均明显增加。结果表明，射线照射损伤小鼠对新环境的探索以及认知能力，照射剂量为4 Gy时对小鼠损伤不明显，电针干预可改善模型小鼠的认知能力。在Morris水迷宫实验中，小鼠逃避潜伏期反映了其寻找平台的空间认知能力。在定位航行实验中，随着训练次数的增加，各组潜伏期均有缩短，但与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期延长，穿越靶象限次数下降，靶象限停留时间缩短，其运动轨迹是随机性的。与模型组比较，电针穴位各组小鼠逃避潜伏期缩短，在靶象限反复寻找平台，停留时间增加，其运动轨迹也多为直线型。行为学实验结果表明，模型组小鼠空间记忆能力受损，存在明显的学习记忆障碍，通过电针穴位处理的小鼠在水迷宫实验中的空间学习记忆能力有明显提高。

依据行为学实验结果，推测电针对放射性脑损伤的改善作用可能通过以下途径：①改善脑微循环，缓解神经元缺血、缺氧；②诱导内源性神经干细胞的增生与分化，促进神经元再生，修复受损神经网络；③诱导和调控学习记忆相关的基因信号通路。

本实验结果提示，大剂量射线照射对小鼠的认知和空间学习记忆能力均有不同程度的损伤，电针处理可使模型小鼠的认知能力和空间学习能力得到一定的恢复。电针治疗放射性脑损伤的机制还需进一步研究，为临床应用作为预防和治疗放射性脑损伤提供科学依据。