Mg²⁺是细胞内主要的阳离子之一，其含量仅次于K⁺，其作为多种酶的辅助因子，参与体内糖、脂肪和蛋白质的代谢，是机体必不可少的重要金属元素。近年来Mg²⁺对中枢神经系统的保护作用受到广泛关注。Vacanti和Ames^[1]提出，Mg²⁺含量的下降是导致中枢神经系统(CNS)继发性损伤的因素之一，损伤后及时补充Mg²⁺可以减轻CNS的损害。在CNS继发性损伤中Mg²⁺下降的幅度与组织损伤程度成正比^{[2, 3]}。前期研究表明，SD大鼠RBI模型中Mg²⁺含量下降，而补充MgSO₄可减轻SD大鼠RBI脑组织的早期炎症反应^{[4, 5, 6]}。本实验旨在探讨Mg²⁺对RBI的保护作用机制。

1. 试剂与仪器：硫酸镁注射液(产品批号：12073142)购于北京国药集团容生制药有限公司。Primus M医用直线加速器购于德国Siemens公司。电感耦合等离子体发射光谱仪(iCAP 6000)购于德国斯派克公司。

2. 动物及分组：Sprague-Dawley大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证编号：SCXK(沪)2012-0002。按照SPF级管理，鼠龄8周，健康雄性，体重300～320 g，在苏州大学医学部放射医学与防护学院中心实验室动物屏障系统内饲养。用随机数字表法将54只大鼠分为空白组、照射组和防护组，照射组和防护组分为照后1、3、7、14、30和60 d，空白组相同条件下饲养相应天数，每个时间点3只。防护组按照400 mg/kg体重腹腔注射10%MgSO₄溶液^[4]，照射组腹腔注射相同体积的生理盐水。防护组和照射组于照射前1 d，照后30 min，照后连续3 d给药，共给药5次。

3. 大鼠放射性脑损伤模型建立：SD大鼠用10%的水合氯醛经腹腔注射麻醉，0.35 ml/100 g体重，俯卧位，固定在自制的固定板上。对防护组和照射组SD大鼠进行单次全脑20 Gy电子束(5 MeV，剂量率2 Gy/min，源皮距100 cm)照射，利用挡铅对射野内的大鼠眼睛及鼻腔进行屏蔽防护。

4. 脑组织含水量(BWC)测定：分别于照射后1、3、7、14及30 d断头处死大鼠，每组3只，快速取出脑，用滤纸吸去组织表面水分，分析天平精确称量湿重后，置于烘箱中干燥，每24小时称重一次，直到前后两次重量差小于1%，用分析天平精确称量脑组织干重。利用干湿重法公式：样本干湿比(%)=(样本湿重-样本干重)/样本湿重×100%，计算脑组织含水量。

5. HE标本染色：大鼠断头取出脑组织后，在甲醛溶液中浸泡24 h以上。脑组织经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、脱蜡、水化等步骤得到组织病理切片，HE染色，中性树胶封片。

6. 海马金属元素测定：分别于照射后1、3、7、14、30及60 d断头处死动物，每组3只，快速取出海马，用滤纸吸去组织表面水分，分析天平精确称量，浓盐酸和浓硝酸混合(3∶1)浸泡过夜，次日用加热板加热，彻底消解，去离子水定容至5 ml，电感耦合等离子体发射光谱仪(iCAP 6000)检测海马中的Ca、Mg、Zn、Cu、Fe等元素的含量。

7. 统计学处理：数据用x±s 表示。采用GraphPad Prism 5软件进行统计和作图，采用t检验对各组含水量及Ca、Mg、Cu、Fe、Zn含量进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

1. BWC的变化：结果列于表 1。由表 1可知，照射组大鼠脑组织受到照射后7 d开始出现脑水肿，而且随着时间的推移，脑组织水肿持续存在，在照射后7、14、30 d较空白组加重，差异有统计学意义(t=-3.21、-2.11、2.82，P＜0.05)；防护组在照射后7、14 d，脑组织含水量高于空白组，差异有统计学意义(t=9.26、2.71，P＜0.05)，但是防护组与照射组相应时间点对比，脑含水量降低，在照射后7、14、30 d差异有统计学意义(t=2.84、4.33、1.90，P＜0.05)。表明MgSO₄可以减轻照射引起的脑组织水肿程度。

表 1(Table 1)

表 1 大鼠脑组织在照后不同时间的含水量Table 1 Content of rats′ brain water at different time intervals after radiation (%， x±s) 组别 只数 1 d 3 d 7 d 14 d 30 d 空白组 3 75.13±0.82 74.97±0.63 75.34±0.35 74.90±0.66 74.94±0.40 照射组 3 75.96±2.49 76.80±2.56 79.48±0.32 a 80.71±1.24 a 78.07±1.57 a 防护组 3 75.54±1.09 76.40±2.69 77.49±0.68 ab 76.32±0.64 ab 75.03±1.24 b 注： a与空白组比较，t =9.26、2.71、-3.21、-2.11、2.82，aP<0.05；b与照射组比较，t=2.84、4.33、1.90，P <0.05

表 1 大鼠脑组织在照后不同时间的含水量 Table 1 Content of rats′ brain water at different time intervals after radiation

2. 脑微血管及内皮细胞病理学改变：结果示于图 1。照射组在照后3 d即出现血管间隙变宽及血栓高峰，7 d血管间隙进一步增宽，血管内膜细胞坏死，照后14 d起，照射组出现血栓机化再通；防护组在照后3 d也出现了血管间隙变宽并伴随血栓形成，但是较照射组血栓明显减少，在照后7 d血管间隙几乎恢复正常，但是血管腔内仍有少量血栓。表明补充MgSO₄可以减轻脑微血管的损伤。

图 1(Figure 1)

注：黑色箭头所指向为脑组织微血管 图 1 大鼠皮质区域在照后不同时间的镜下观察 HE染色 ×400 A~C.照射组照后3、7、14 d;D~E.防护组照后3、7 d;F.空白组 Figure 1 HE staining brain tissue of cerebral cortex at different time intervals after radiation ×400. Black arrow directs to the microvascular in the irradiated group after 3，7，14 d of radiation (A-C), in the protective group after 3 and 7 d of radiation (D-E), and in the control group (F)

3. Mg含量的变化：结果列于表 2。由表 2可知，防护组海马组织Mg含量较照射组与空白组高，与照射组比较，在照射后1、3、7、14 d差异有统计学意义(t=5.71、3.98、8.95、4.68，P <0.05)，与空白组比较，仅在照射后1 d差异有统计学意义(t=3.74，P<0.05)，照射组Mg含量各时间点均低于空白组，在7 d差异有统计学意义(t=5.85，P<0.05)。表明照射可降低海马组织Mg含量，补充MgSO₄可增高海马组织的Mg含量。

表 2(Table 2)

表 2 大鼠脑海马Mg照后不同时间的含量Table 2 Content of Mg in hippocampus at different time intervals after radiation (%，x±s) 组别 只数 1 d 3 d 7 d 14 d 30 d 60 d 空白组 3 35.03±1.33 34.75±3.00 33.67±2.80 33.58±1.09 31.92±0.53 33.61±4.19 照射组 3 31.24±1.61 29.59±3.31 22.81±2.54 a 24.94±3.43 28.24±4.36 28.75±7.54 防护组 3 42.25±3.52 ab 40.31±3.56 b 39.43±1.10 b 39.13±5.33 b 41.44±7.88 42.65±4.89 注：a与空白组比较，t=3.74、5.85，P<0.05；b与照射组比较，t=5.71、3.98、8.95、4.68，P<0.05

表 2 大鼠脑海马Mg照后不同时间的含量 Table 2 Content of Mg in hippocampus at different time intervals after radiation

4. Ca含量的变化：结果列于表 3。由表 3可知，照射组海马组织Ca含量较防护组与空白组高，在照后各时间点差异均具有统计学意义(t=4.23、3.57、4.01、4.73、3.78、3.44和8.47、6.86、7.78、9.50、6.84、7.30，P<0.05)，防护组与空白组比较也有升高，在照后1 d差异有统计学意义(t=6.04，P<0.05)。表明补充MgSO₄可以减轻细胞钙超载。

表 3(Table 3)

表 3 大鼠脑海马照后不同时间的Ca含量Table 3 Content of Ca in hippocampus at different time intervals after radiation (10-2mg/g， x±s) 组别 只数 1 d 3 d 7 d 14 d 30 d 60 d 空白组 3 35.33±1.96 35.52±2.07 34.94±1.88 35.32±1.30 37.45±0.65 37.37±1.44 照射组 3 77.36±7.27 a 55.18±5.33 a 55.25±2.06 a 53.45±0.67 a 51.51±2.05 a 46.03±1.22 a 防护组 3 57.62±2.11 ab 39.94±2.18 b 39.31±1.28 b 38.40±1.70 b 39.92±3.75 b 37.39±0.72 b 注：a与空白组比较，t=6.04、11.41、6.81、14.03、17.17、6.89、9.12，P<0.05；b与照射组比较，t=5.35、5.28、11.02、14.26、5.68、9.10，P<0.05

表 3 大鼠脑海马照后不同时间的Ca含量 Table 3 Content of Ca in hippocampus at different time intervals after radiation

5. Fe含量的变化：结果列于表 4。由表 4可知，照射组海马组织Fe含量较防护组与空白组高，与空白组比较，在照后1、3、7 d差异有统计学意义(t=5.43、5.66、3.60，P <0.05)，防护组较空白组升高，在照射后1、3 d差异有统计学意义(t=3.44、4.42，P <0.05)。表明补充MgSO₄可以减轻细胞铁超载。

表 4(Table 4)

表 4 大鼠脑海马照后不同时间的Fe含量Table 4 Content of Fe in hippocampus at different time intervals after radiation (10-2mg/g， x±s) 组别 只数 1 d 3 d 7 d 14 d 30 d 60 d 空白组 3 14.01±0.96 14.52±1.18 17.62±2.29 14.51±1.53 17.57±5.34 19.16±3.56 照射组 3 27.87±3.62 a 27.92±4.70 a 25.73±2.84 a 27.52±2.19 28.35±5.07 29.07±2.81 防护组 3 22.80±3.91 a 24.99±1.30 a 22.38±3.07 26.15±3.86 27.55±7.38 26.18±6.46 注：a与空白组比较，t=3.44、4.42、5.43、5.66、3.60，P<0.05

表 4 大鼠脑海马照后不同时间的Fe含量 Table 4 Content of Fe in hippocampus at different time intervals after radiation

6. Cu含量的变化：结果列于表 5。由表 5可知，防护组海马组织Cu含量较照射组和空白组低，在照后各时间点差异均有统计学意义(t=4.23、3.57、4.01、4.73、3.78、3.44和8.47、6.86、7.78、9.50、6.84、7.30，P<0.05)，照射组较空白组也降低，且在照射后1、7、14、60 d差异有统计学意义(t=4.24、3.76、4.76、3.86，P<0.05)。表明补充MgSO₄可加速铜的降低。

表 5(Table 5)

表 5 大鼠脑海马照后不同时间的Cu含量Table 5 Content of Cu in hippocampus at different time intervals after radiation (10-4mg/g， x±s) 组别 只数 1 d 3 d 7 d 14 d 30 d 60 d 空白组 3 57.08±7.19 56.25±7.17 58.53±2.45 57.89±1.39 56.39±7.95 55.24±6.60 照射组 3 40.82±1.37 a 42.33±5.32 47.04±5.84 a 45.08±5.39 a 43.80±2.85 40.51±4.27 a 防护组 3 24.60±3.55 ab 27.15±1.11 ab 34.77±1.38 ab 32.35±1.20 ab 28.22±2.25 ab 27.36±1.91 ab 注：a与空白组比较，t=8.47、6.86、7.78、9.50、6.84、7.30、4.24、3.76、4.76、3.86，P<0.05；b与照射组比较，t=4.23、3.57、4.01、4.73、3.78、3.44，P<0.05

表 5 大鼠脑海马照后不同时间的Cu含量 Table 5 Content of Cu in hippocampus at different time intervals after radiation

7. Zn含量的变化：结果列于表 6。由表 6可知，照射组海马组织Zn含量较防护组和空白组降低，分别于照后14 d和照后1、7、14、30、60 d差异有统计学意义(t=6.21和5.25、4.78、26.53、6.67、11.37，P<0.05)，防护组也较空白组降低，且在照后1、7、14、30、60 d差异有统计学意义(t=6.04、4.01、20.32、6.21、9.83，P<0.05)。表明补充MgSO₄可缓解锌的降低。

表 6(Table 6)

表 6 大鼠脑海马照后不同时间的Zn含量 Table 6 Content of Zn in hippocampus at different time intervals after radiation (10-3 mg/g， x±s) 组别 只数 1 d 3 d 7 d 14 d 30 d 60 d 空白组 3 53.74±2.19 53.74±1.02 51.60±3.65 50.04±1.05 48.94±5.63 52.55±2.30 照射组 3 42.83±2.27 a 39.42±2.70 32.68±6.52 a 28.26±1.26 a 29.06±1.57 a 29.19±2.91 a 防护组 3 41.19±3.07 a 44.55±7.48 35.72±3.82 a 33.36±0.59 a 30.42±2.39 a 32.36±2.30 a 注：a与空白组比较，t=6.04、4.01、20.32、6.21、9.83、5.25、4.78、26.53、6.67、11.37，P<0.05；b与照射组比较，t=6.21，P<0.05

表 6 大鼠脑海马照后不同时间的Zn含量 Table 6 Content of Zn in hippocampus at different time intervals after radiation

目前放射生物学理论认为，RBI的发生机制与其他类型脑损伤发生机制相似，也存在着兴奋性氨基酸的释放、钙离子超载、基因调控及炎症因子的表达、自由基的损伤等。这些因素在RBI发生发展过程中互为因果，共同形成多因素多通路的综合作用。

射线作用于脑组织血管内皮细胞，破坏血脑屏障，导致血管源性水肿，此为放射性脑损伤的主要特征之一。本实验利用脑组织干湿比法来研究RBI模型脑水肿的变化趋势，结果发现，在脑组织受到照射后7 d开始出现脑水肿，至14 d脑水肿的程度最重。前期研究结果显示,脑毛细血管血栓在受照后1 d开始形成，3 d达到高峰，14 d时脑毛细血管内血栓出现机化再通^[7]。本实验的结果与此相同，并且还证实，在相同的时间点，防护组的血栓程度较照射组明显减轻。因此，认为RBI后1～3 d BWC并未显著升高可能与血脑屏障相对性关闭有关。在14 d时BWC达到高峰，可能与血栓机化再通有关。补充MgSO₄后，BWC降低，在7、14、30 d与照射组比较，差异有统计学意义，说明 RBI模型成功建立，补充MgSO₄可减轻RBI模型的脑水肿。

细胞内Mg²⁺含量仅次于K⁺，细胞内Mg²⁺可作为调控凋亡的校准器。Mg²⁺可以通过非竞争性拮抗N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体，钙离子竞争结合位点以及维持细胞膜上Na⁺-K⁺-ATP酶的活性来维持细胞内外离子稳态^{[8, 9]}，由此防止细胞内的钙超载和水肿；另外，Mg²⁺对维持DNA的结构稳定有着重要的作用，低Mg²⁺可以使DNA的双螺旋结构发生解旋，降低其稳定性，从而加速细胞的死亡^[10]。Mg²⁺降低还可以降低膜的完整性和功能，并且能增强膜对氧化应激反应的敏感性。本实验结果中，防护组因为补充MgSO₄，所以其Mg²⁺含量高于其他两组。而照射组Mg²⁺含量较另外两组明显下降，在1、3、7、14 d下降较防护组差异有统计学意义，这也符合在放疗中患者的血清Mg²⁺含量降低的事实。

放射性脑损伤的发病机制可能与Ca²⁺的细胞内流和Fe²⁺、Fe³⁺的氧化还原反应产生自由基有关^{[11, 12]}。Ca²⁺在细胞内承担着第二信使等重要作用，适当浓度的游离Ca²⁺对维持细胞正常的生理生化过程起着十分重要的作用。研究表明，电离辐射可引起Ca²⁺大量内流，造成细胞内Ca²⁺超载，而细胞内Ca²⁺超载是公认的导致脑损伤后细胞死亡的共同通道^[13]。Fe参与机体氧气运输、能量的代谢以及DNA的合成，当细胞内Fe超载时，可通过Feton反应产生大量的自由基，而后者可以攻击细胞膜脂质、蛋白和DNA，从而导致细胞死亡。在本实验中，RBI模型均有不同程度的Ca²⁺、Fe含量升高，说明射线对脑部产生损伤，致使Ca²⁺和Fe内流。照射组的Ca²⁺、Fe含量高于防护组，说明补充MgSO₄后，放射性脑损伤有所减轻。早在缺血性脑损伤中就有报道，钙通道阻滞剂可减轻缺血性脑损伤^[14]。使用钙通道阻滞剂作为放射防护剂是由Massaccesi等^[15]提出的，因为放射损伤产生的钙稳态失衡，钙通道阻滞剂可以阻止或者纠正这种失衡状态；此外，钙通道阻滞剂具有抗氧化性质，可以减轻照射引起的氧自由基损伤。同样，对于铁超载，有很多研究提出使用铁螯合剂纠正铁的超载，从而减轻损伤^[16]。

前期研究表明，大鼠脑组织受到20 Gy电子线照射后，其匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力明显下降^[17]。众所周知，细胞内SOD存在的主要形式是Cu-Zn SOD酶。本实验中，RBI模型Cu²⁺、Zn²⁺含量均有所下降，补充MgSO₄后Cu²⁺含量下降更为明显，在3～14 d变化速率最大，这和Petryna^[18]的研究结果相同；补充MgSO₄后可缓解照射引起Zn²⁺的下降，间接增加了Cu-Zn SOD酶的含量。实验中20 Gy电子线照射可以降低海马组织的Cu²⁺、Zn²⁺含量，间接导致Cu-Zn SOD酶的降低，这也符合前面课题组关于照射后脑组织SOD活性下降的结论，至于补充MgSO₄后Cu含量下降，而Zn含量增高的具体机制仍有待研究。

SD大鼠全脑照射后，相对于空白组，RBI组均有脑水肿和微血管血栓形成。它的影响是两方面的，如本课题组前面所证明，照射致大鼠脑组织内Mg²⁺含量下降，而Mg²⁺的降低又导致了细胞内的Ca²⁺的增多，也导致了黄嘌呤氧化酶的大量产生，并激活ATP酶致ATP分解，ATP分解生成的次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下产生自由基，降低Cu-Zn SOD酶的活性，从而使细胞内多余的Cu²⁺、Zn²⁺排出细胞内。照射后脑组织水肿、微血管血栓形成，导致了脑组织缺血缺氧，从而使呼吸链脱节，发生自动氧化，使O₂还原成超氧阴离子自由基(O₂^-·)，O₂^-·又能通过Fenton反应直接衍生成羟自由基(OH^-·)，而照射后细胞内铁超载也加速了Fenton反应产生OH^-·，从而致使脑组织细胞的损伤和死亡。但是补充MgSO₄后，防护组相对于照射组降低了Ca、Fe和Cu含量，增加了Zn含量，从而纠正了细胞内各种重要元素的不平衡。

综上所述，本实验证明在单次电子线20 Gy全脑垂直照射下，放射性脑损伤模型成功建立，补充MgSO₄后可以一定程度上缓解放射性脑损伤。对于海马，从Ca、Cu、Fe、Mg、Zn 5种元素阐明了各个元素的放射生物学作用，也初步得出了MgSO₄在放射性脑损伤中的防护作用，但是这些元素之间的相互作用机制比较复杂，还有待后续的研究来阐明。