2016, Vol. 36
近年来, 分子生物学在放射医学研究领域得到广泛应用, 对辐射损伤的研究已从研究外周血淋巴细胞染色体畸变率及微核细胞率深入到对基因表达变化及相应的通路变化的研究。多项研究结果表明, 机体对辐射损伤的应答机制非常复杂, 目前尚未完全清楚。本实验室前期研究了不同受照剂量及照后不同时间点人外周血淋巴细胞差异基因表达谱的变化, 发现了一些有意义的差异基因和信号通路[1-2], 但离体和整体照射对动物外周血淋巴细胞基因表达和信号通路是否有影响及影响程度尚不清楚。因此, 本研究主要以离体和整体暴露γ射线后6 h大鼠外周血淋巴细胞为实验材料, 研究2 Gy γ射线对差异基因表达的影响, 以期为辐射损伤研究提供新靶点, 为辐射损伤应答机制研究提供实验数据。
材料与方法1.实验动物:SPF级雄性SD大鼠12只, 体质量200~220 g, 购于军事医学科学院实验动物中心, 生产许可证号:SCXK (军)2007-004, 质量合格证号:00130908。于中国辐射防护研究院动物实验中心屏障环境中饲养管理, 实验动物使用许可证号:SYXK (晋)2008-0004。
2.试剂和仪器:RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司), 淋巴细胞分离液和D-Hank's液(北京索来宝科技有限公司), TRIzol试剂(美国Invitrogen公司), RNeasy Mini Kit试剂盒(德国QIAGEN公司), Agilent SurePrint G3 Rat Gene Expression 8×60K芯片(上海欧易生物医学科技有限公司)。GWGP-80型60Co γ源治疗机(中国辐射防护研究院附属医院放射治疗中心), LightCycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。
3.动物分组及处理:采用分段均衡随机分组法分为离体照射对照组、离体照射组、整体照射对照组和整体照射组4组, 每组3只大鼠。离体照射组动物经腹主动脉采血, 无菌条件下加入等体积的D-Hank's液混匀, 沿离心管壁加入等体积的淋巴细胞分离液后, 2 000 r/min离心20 min, 离心半径15 cm。离心后吸取中间层淋巴细胞, 加入等体积D-Hank's液重复离心1次, 提取淋巴细胞至RPMI 1640培养基中, 于37℃、5%CO2培养箱中过夜, 经2 Gy γ射线照射, 吸收剂量率117.1 cGy/min。整体照射组动物先经γ射线全身照射, 于照后6 h经腹主动脉采血, 提取淋巴细胞。
4.大鼠外周血淋巴细胞总RNA的提取:照射后6 h, 参照TRIzol试剂的操作说明书进行淋巴细胞总RNA的提取。使用RNeasy Mini Kit试剂盒纯化总RNA。
5.芯片杂交:用纯化后的RNA合成cDNA, 再进行荧光标记的cRNA的合成、纯化及浓度测定, 最后进行芯片杂交。
6.基因本体(GO)富集分析:对筛选出的差异表达3倍以上的基因进行基因本体(gene ontology, GO)分析, 统计每个GO语义中所包含的差异基因个数, 并用统计检验的方法计算每个GO语义中差异基因富集的显著性。通过GO分析对差异基因进行分子功能、细胞组分和生物学过程的分类。
7. KEGG富集分析:结合京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)数据库, 对差异基因进行通路显著性分析, 分析每个通路中所包含的差异基因个数, 计算每个通路中差异基因富集的显著性。其中, P值越小, 该通路与所富集的差异基因的相关性就越大。
8.基因芯片结果验证:采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术, 选择tRNA转甲基酶61A (Trmt61a)基因和外胚层神经皮质基因1(ectodermal-neural cortex 1, Enc1)对芯片结果进行验证。β-肌动蛋白为内参基因, 引物序列见表 1。PCR扩增条件:95℃, 15 min; 95℃, 10 s; 60℃, 30 s; 40个循环。采用2-△△Ct法, △△Ct=(对照组目的基因Ct值-对照组管家基因Ct值)-(照射组目的基因Ct值-照射组管家基因Ct值), 计算2条基因相对表达量, 比值 > 1表示相对于对照样本, 该基因表达上调; 比值 < 1表示相对于对照样本, 该基因表达下调。
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表 1 PCR扩增基因的引物序列 Table 1 Primer sequence of the amplified gene for PCR assay |
结果
1.大鼠外周血淋巴细胞离体照射组与整体照射组差异表达基因:用基因芯片检测比较2 Gy 60Co γ射线照后6 h大鼠外周血淋巴细胞的基因差异表达情况。与对照组相比, 离体照射组筛选出差异表达3倍以上的基因534条, 其中, 上调表达基因332条, 下调表达基因202条。与对照组相比, 整体照射组筛选出差异表达3倍以上的基因1 084条, 其中, 上调表达基因736条, 下调表达基因348条。离体照射组与整体照射组差异表达3倍以上的共同差异基因有55条, 只在离体照射组差异表达3倍以上的基因有479条, 只在整体照射组差异表达3倍以上的基因有1 029条。
2.大鼠外周血淋巴细胞差异表达基因的GO富集分析:根据GO分析对基因的注释, 对离体照射组534条差异表达基因进行分子功能、细胞组分及生物学过程的分类, 各有91、28、253个功能簇。对整体照射组1 084条差异表达基因进行分子功能、细胞组分及生物学过程的分类, 各有96、30、184个功能簇。
根据GO分析对基因的注释, 对55条离体照射组与整体照射组共同差异表达基因进行分子功能、细胞组分及生物学过程的分类, 各有31、15、100个功能簇。所涉及的主要差异表达基因及转录域覆盖率见表 2~4。
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表 2 2 Gy γ射线照后6 h大鼠外周血淋巴细胞共同差异表达基因的主要分子功能簇 Table 2 The main molecular functional clusters involved in the common differential genes of rat peripheral blood lymphocytes at 6 h after exposure to 2 Gy γ-rays |
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表 3 2 Gy γ射线照后6 h大鼠外周血淋巴细胞共同差异表达基因的主要细胞组分簇 Table 3 The main cellular components involved in the common differential genes of rat peripheral blood lymphocytes at 6 h after exposure to 2 Gy γ-rays |
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表 4 2 Gy γ射线照后6 h大鼠外周血淋巴细胞共同差异表达基因的主要生物学过程簇 Table 4 The main biological processes clusters involved in the common differentially expressed genes of rat peripheral blood lymphocytes at 6 h after exposure to 2 Gy γ-rays |
3.差异表达基因的KEGG富集分析:对离体照射组与整体照射组差异表达基因分别进行KEGG富集分析发现, 离体照射组差异表达基因涉及27个生物学通路, 整体照射组差异表达基因涉及18个生物学通路, 两组有13个共同的生物学通路(表 5)。
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表 5 2 Gy γ射线照后6 h大鼠外周血淋巴细胞离体照射组与整体照射组共同的生物学通路 Table 5 The common biological pathways of rat peripheral blood lymphocytes in vitro and in vivo at 6 h after exposure to 2 Gy γ-rays |
对55条离体照射组与整体照射组共同差异表达3倍以上的基因进行KEGG富集分析发现, 涉及6个生物学通路(表 6)。
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表 6 2 Gy γ射线照后6 h大鼠外周血淋巴细胞离体照射组与整体照射组共同差异基因涉及的生物学通路 Table 6 The biological pathways involved in the common differential genes of rat peripheral blood lymphocytes in vitro and in vivo at 6 h after exposure to 2 Gy γ-rays |
4.基因芯片验证结果:相对实时荧光定量PCR结果显示, Trmt61a和Enc1 2条基因的溶解曲线均为单一峰, 表明PCR扩增特异性较好。采用2-△△Ct法, 对2条基因的表达量进行分析, 如表 7所示, Trmt61a基因离体照射组和整体照射组的定量比值均 < 1, 为低表达; Enc1基因的定量比值均 > 1, 为高表达。此两条基因的RT-PCR结果与基因芯片检测结果一致, 进一步证实了芯片结果的可靠性。
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表 7 2 Gy γ射线照后6 h大鼠外周血淋巴细胞RT-PCR扩增的相对定量结果 Table 7 Relative quantitative results of RT-PCR amplification in rat peripheral blood lymphocytes in vitro and in vivo at 6 h after exposure to 2 Gy γ-rays |
讨论
细胞的生物学功能是受基因调控的, 因此, 照射后基因表达变化是重要的分子事件, 也是介导细胞辐射反应的分子生物学基础[3-6]。研究辐射后基因表达的变化可以帮助阐明辐射损伤的分子作用机制, 因而对射线较为敏感的淋巴细胞近年来成为研究热点, 其大多针对人外周血淋巴细胞中的某些基因进行研究, 但辐射引起的生物学进程的改变是复杂的, 本实验采用基因芯片技术, 以大鼠的外周血淋巴细胞为对象, 检测了辐照后上万个基因的表达情况, 以期筛选出辐射反应基因, 进而探讨辐射损伤机制。
本实验结果显示, 2 Gy 60Co γ射线照后6 h, 离体照射组筛选出差异表达3倍以上的基因534条, 整体照射组筛选出1 084条。整体照射组筛选出的差异表达基因多于离体照射组, 并且两组都是上调表达基因多于下调表达基因, 表明机体对辐射损伤的应答是多方面和多层次的复杂反应过程。
为明确差异表达基因的功能, 采用GO富集分析, 结果显示, 55条离体照射组与整体照射组共同差异表达基因涉及到细胞众多分子功能、细胞组分及生物学过程的改变, 其中分子功能主要包括钙离子结合、趋化因子受体活性、白细胞介素8结合等。细胞组分主要涉及质膜、细胞外间隙、染色体等。生物学过程主要涉及凋亡、细胞周期、免疫应答、诱导凋亡的p53类介导的DNA损伤应答及信号转导、炎症应答等。
采用KEGG对差异表达基因做细胞信号转导通路分析, 发现离体照射组和整体照射组差异表达基因共同涉及的生物学通路有13个。其中差异表达3倍以上的基因有Il1r2、Ccng1、Bbc3、Fcar、RT1-Bb、Hist1h3a、Cxcl6、Ticam2、Tlr3, 涉及6个生物学通路, 包括造血细胞系、p53信号通路、金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、Toll样受体信号通路。
其中, Il1r2是白细胞介素1受体2(IL-1RⅡ), 也称白细胞介素1(IL-1)的缺陷受体, 能与IL-1β结合, 但结合后不能进一步转导细胞内下游信号, 故对IL-1生物活性起拮抗作用[7]。IL-1是重要的免疫活性分子, 是介导机体急性期反应最重要的活性分子之一, 在感染、炎症等病理过程中起着重要的作用。王洪等[7]发现, IL-1RⅡ的低表达使IL-1的分解代谢作用缺乏有效的拮抗, 导致了骨关节炎的发病。王焱等[8]发现, IL-1RⅡ能够改善大鼠自身免疫性心肌炎。因此, 2 Gy 60Co γ射线照后IL-1RⅡ表达水平的改变很可能影响大鼠机体对辐射损伤的能动反应。
Ccng1和Bbc3是p53信号通路中的关键基因。这条通路上, 很多转录应答取决于肿瘤转录相关因子P53, Kabacik等[4]发现, 与P53相关的辐射敏感性基因包括FDXR、CCNG1、DDB2、BBC3等, 其中Ccng1暴露于2~4 Gy辐射后, 2~24 h内表达持续上调。Ccng1是细胞周期蛋白家族的重要成员, 受p53调控对细胞周期进程负调控, 在细胞增殖和再生过程中具有重要作用[9-10]。有研究发现, Ccng1高表达可增加细胞的辐射敏感性, 导致细胞死亡及DNA损伤[11]。本实验γ射线照后Ccng1表达水平改变很可能影响细胞周期G2期, 导致细胞死亡, 从而引起辐射损伤。Bbc3是p53诱导细胞周期停滞和细胞凋亡的关键靶基因, p53与其靶位点结合后促进Bbc3转录及蛋白表达, 从而诱导细胞凋亡[12-14]。本实验γ射线导致Bbc3表达改变, 推测其可能使淋巴细胞出现凋亡现象。受到照射后的细胞出现DNA双链断裂, 通过激活P53分子信息通路实现DNA损伤应答。
Ticam2是TRIF相关转接分子(TRAM)也被称为包含TIR结构域的转接分子2, 是Toll样受体信号通路转导途径中, 包含TIR结构域的接头蛋白分子。Toll样受体通过感知不同微生物刺激, 招募特异接头蛋白, 激活一系列信号级联反应, 引发针对病原体的特异性免疫应答, 是连接天然免疫和特异性免疫应答的桥梁。Toll样受体信号通路中TLR4途径特异要求TRAM的存在, TRAM可介导IRF-3、IRF-7和NF-KB的活化[15]。因此, 本实验中照射后Ticam2的表达改变可影响大鼠淋巴细胞中TLR4介导的细胞因子的产生和B细胞的活化, 从而影响机体的免疫应答反应。
本研究从所筛选的差异表达基因中挑选了差异较为显著且离体照射组和整体照射组表达一致的Trmt61a和Encl进行荧光定量PCR扩增, 其结果与基因芯片表达趋势一致, Trmt61a基因表达下调, Encl则表达上调, 证明基因芯片结果有效可信。
转运RNA甲基转移酶61A (Trmt61a)定位于细胞核中是Trmt61B的横向同源物。Trmt61B基因编码特定线粒体中的tRNA甲基转移酶, 使3个tRNA上第58个碱基甲基腺苷化。1-甲基腺嘌呤核苷是tRNA核苷修饰的一种, tRNA分子通过修饰核苷来增加信息以满足精准高效地翻译遗传密码的需要。Trmt61a能使细胞质中的tRNA核苷修饰。研究发现siRNA靶向沉默Trmt61a可导致缓慢生长现象, 这表明Trmt61a在细胞增殖中发挥作用。而标记的Trmt61a-Flag在人宫颈癌细胞中也可被观察到[16]。本实验中, Trmt61a在离体照射组与全身照射组中都表达下调, 提示2 Gy γ射线照后6 h内, 大鼠外周血淋巴细胞的增殖会受到影响。
综上所述, 本研究筛选出一些辐射反应基因和信号通路, 并且用荧光定量PCR验证了Trmt61a和Enc1的表达变化, 探讨了大鼠外周血淋巴细胞复杂的、多基因协同作用的辐射应答反应, 为进一步进行辐射损伤机制的研究提供良好的依据。
利益冲突 本人、本人家属及其他研究人员在进行该研究时, 未因本人执行此研究而获得职务、金钱及其他不正当的财务利益作者贡献声明 袁慧负责检索文献并撰写论文; 李建国负责设计实验内容, 指导实验方案; 尹晶晶和秦秀军负责实验实施及操作; 李钢负责提供动物照射设施及指导
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