2016, Vol. 36
2. 100101 北京, 解放军第306医院放疗中心 ;
3. 100190 北京, 中国科学院理化技术研究所光化学转换与功能材料重点实验室
2. Center for Therapeutic Radiology and Oncology, No. 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China ;
3. Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Science, Beijing 100190, China
辐射所引起的免疫损伤及免疫功能障碍在核辐射事故、放射治疗等患者中非常常见，轻者可能会有长期的免疫功能的低下，甚至会导致严重的全身感染，甚至死亡，至今尚无有效的防治措施。胶原蛋白为细胞外基质的主要成分，具有重要的生物学功能，如参与细胞增殖、分化、及细胞间信息的传递，而且与细胞免疫、组织的形成、肿瘤细胞的转移等密切相关[1-2]。胶原蛋白经过酶解变成胶原蛋白肽，活性基团能够得到更充分暴露，从而使其更容易发挥作用[3]。研究显示，胶原蛋白肽具有多种生物学活性[4-6]，其中包括对免疫功能的调节作用[7]。前期研究显示，在糖皮质激素诱导的免疫抑制小鼠中，胶原蛋白肽能够增强其免疫功能[8]。本研究旨在了解胶原蛋白肽是否对X射线照射引起的小鼠免疫功能降低具有改善作用。
材料与方法1.主要仪器及试剂：X射线照射采用瑞典医科达公司生产的AXESSE医用电子直线加速器，酶标仪采用美国生产的BIO-RAD680。细胞因子IL-2 ELISA检测试剂盒购自深圳欣博盛公司。牛骨胶原蛋白肽（CP）来自中国科学院理化技术研究所郭燕川研究室；RPMI 1640细胞培养液购自美国GIBCO公司；胎牛血清购于杭州四季青生物材料有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂为美国Amresco公司产品；ConA来源于美国Sigma公司。
2.实验动物：SPF级雄性ICR小鼠，6～8周龄，24～30 g，由北京大学医学部实验动物医学中心提供，合格证号为SCXK（京）2011-0012。
3.照射条件：6 MV X射线单次全身照射，源皮距100 cm，吸收剂量率6 Gy/min，照射剂量分别为2和5 Gy，照射野30 cm×30 cm，健康对照组进行假照射。
4.动物分组及给药方案：小鼠按体重分层随机分为5组，每组7只。分为健康对照组、2 Gy照射组、5 Gy照射组、2 Gy+CP 600 mg/kg（2 Gy CP）组和5 Gy+CP 600 mg/kg（5 Gy CP）组。照射与CP联合组小鼠给药后当天进行照射，每只分别给予腹腔注射无菌注射用水稀释的胶原蛋白肽600 mg/kg体重，连续给药7 d；健康对照组和照射组小鼠从实验的第1天开始，连续7 d注射相同容积的无菌注射用水。于实验的第8天将小鼠行断颈处死，在无菌条件下取脾，检测相关指标。
5.小鼠体质量及胸腺和脾脏指数的观察：小鼠分别在实验前和处死前进行称重，处死后，取胸腺，无菌取脾，称量小鼠脾脏和胸腺的重量，计算脾脏和胸腺指数采用公式：指数=脾脏或胸腺的质量(mg)/体质量(g)。
6.检测脾脏淋巴细胞的增殖能力：方法参照文献[9]，无菌取脾，碾磨，制备脾细胞悬液，离心1 000 r/min，离心5 min，离心半径为18 cm。后加红细胞裂解液，室温放置5～10 min，离心1 000 r/min，离心5 min，离心半径为18 cm，去除红细胞碎片。用PBS洗细胞两次，用RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清）悬浮细胞，制备脾细胞悬液（1×107/ml）。于96孔板中每孔加脾细胞悬液100 μl，及ConA稀释液100 μl，ConA终浓度为5 μg/ml，空白孔以100 μl培养液代替ConA，共培养48 h，每孔加MTT 20 μl，培养4～6 h，吸去上清，然后加DMSO 100 μl，于波长490 nm测定吸光度（A）值，增殖指数的计算：ConA孔A490/空白孔A490。
7.小鼠脾细胞因子IL-2的检测：按方法6制备脾细胞悬液及ConA刺激脾细胞培养48 h，吸取脾细胞上清液，分别加到1.5 ml离心管中，1 500 r/min离心10 min，离心半径16 cm，吸出上清分装，-80℃保存。用ELISA检测试剂盒按照厂家提供的方法测定细胞上清液中IL-2浓度。根据标准品的浓度和OD值，绘制标准曲线，计算待检测样品中相应IL-2的含量。
8.统计学处理：采用SPSS 16.0统计软件进行分析，结果用x±s表示。组间比较采用Student′s-t检验和单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结果1. 补充胶原蛋白肽对小鼠体质量、胸腺及脾脏指数的影响：实验结果见表 1。实验前、后各组小鼠之间体质量均无明显差异。与健康对照组相比，照射组小鼠脾脏和胸腺显著缩小，胸腺指数和脾脏指数与健康对照组相比均明显降低（F=76.857、181.870，P<0.05），其中2和5 Gy照射组小鼠的脾脏指数分别下降了44.2%和67.4%，胸腺指数分别下降了43.8%和56.3%。与2 Gy照射组比较，5 Gy照射组的脾脏指数和胸腺指数均明显缩小（t=2.306、2.228，P<0.05）。补充胶原蛋白肽后，胸腺和脾脏萎缩有明显恢复现象，胶原蛋白肽组小鼠的脾脏指数和胸腺指数均显著高于同等剂量单纯照射组，其中2 Gy CP组和5 Gy CP组的脾脏指数分别升高了45.8%和50%，胸腺指数分别升高了44.4%和42.9%，但仍明显低于健康对照组。
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表 1 胶原蛋白肽对X射线照射小鼠体重、胸腺及脾脏指数的影响（x±s） Table 1 Effects of collagen peptides on body weights and indexes of thymus and spleen in X-ray irradiated mice（x±s） |
2. 胶原蛋白肽对X射线照射小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响：结果显示，健康对照组小鼠脾脏淋巴细胞增殖指数为6.97±1.68，2 Gy组小鼠脾脏淋巴细胞增殖指数（2.08±0.58）较健康对照组下降了70%（t=2.365,P<0.05），5 Gy组（1.18±0.25）较健康对照组下降了83%（t=2.447,P<0.05）。而经补充胶原蛋白肽后，脾脏淋巴细胞的增殖指数明显升高，与同等剂量的单纯照射组相比，2 Gy CP组小鼠脾脏淋巴细胞增殖指数（2.73±0.62）升高了31%（P>0.05），5 Gy CP组（1.62±0.14）升高了37%（t=2.262,P<0.05），但仍明显低于健康对照组（t=2.447,P<0.05）。
3. 补充胶原蛋白肽对X射线照射小鼠脾脏淋巴细胞IL-2水平的影响：结果显示，与健康对照组的IL-2水平（621.8±174.3）pg/ml相比，X射线照射使小鼠脾脏淋巴细胞IL-2的产量显著减少，2 Gy（377.0±34.0）pg/ml和5 Gy组（381.3±106.7）pg/ml的IL-2水平分别下降了39.3%（t=2.447,P<0.05）和38.6%（t=2.262,P<0.05）。而补充胶原蛋白肽后，IL-2的分泌量明显升高，与同一剂量单纯照射组相比，2 Gy CP组（426.3±137.4）pg/ml脾细胞IL-2分泌量升高了约13%（P>0.05），5 Gy CP组（593.9±158.7）pg/ml升高了约55%（t=2.262,P<0.05）。
讨 论免疫系统具有免疫自稳、免疫防御和免疫监视的功能，在肿瘤防御和抗微生物感染中具有非常重要的作用。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，脾脏含有大量的淋巴细胞，是体液免疫和细胞免疫的中心，胸腺是T淋巴细胞发育和成熟的场所。胸腺和脾脏指数在一定程度上可以反映机体免疫功能水平[10-11]。免疫系统对电离辐射非常敏感，辐射可以引起患者免疫功能损伤，而表现为免疫器官的功能异常。Luo-Owen等[12]发现，小鼠经不同剂量质子线全身照射后，胸腺指数、脾脏指数以及相应的脏器质量均较假照射组明显降低，且随照射剂量的增大，降低更为显著。本研究也显示，X射线照射后胸腺和脾脏均明显萎缩，胸腺指数和脾脏指数明显降低，说明X射线照射后免疫功能显著降低，这也是辐射所致的常见不良反应，而且容易引起一系列并发症，甚至造成全身严重感染而死亡。因此，改善或纠正辐射所致的免疫功能异常，对患者的康复非常重要。
胶原蛋白肽作为细胞外基质的主要成分，可以参与细胞的多种生物学功能，并调节免疫功能。有研究显示，地塞米松所诱导免疫抑制动物模型给予0.4、0.8、1.6 g/kg胶原蛋白，可以明显提高小鼠的脾脏和胸腺指数，增强脾脏的超氧化物歧化酶（SOD）活力，使血浆中的溶菌酶含量明显提高[9]。还有研究采用强的松制作小鼠免疫抑制模型，分别给予不同来源（牛羊骨、暹罗鳄骨、鱼鳞等）的胶原蛋白，结果显示多种胶原蛋白均可增强巨噬细胞的吞噬功能及脾脏淋巴细胞的增殖能力[13]。前期研究显示，用地塞米松诱导免疫功能抑制小鼠模型，腹腔注射100、300、600 mg/kg胶原蛋白肽后，可以使外周血淋巴细胞数和中性粒细胞数，胸腺指数、脾脏指数、脾脏淋巴细胞增殖能力均有不同程度的恢复，并呈现一定的剂量依赖性，其中剂量为600 mg/kg的胶原蛋白肽作用最明显，可以使小鼠的脾脏指数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比基本恢复到正常健康对照组水平[8]，说明使用胶原蛋白肽可以显著增强糖皮质激素诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能。但对于射线引起的免疫功能的改变是否有调节作用尚不清楚。
本研究结果显示，经腹腔注射胶原蛋白肽（600 mg/kg体重）后，不论是2 Gy还是5 Gy X射线照射小鼠，这些指标均有明显恢复，小鼠脾脏指数、胸腺指数、脾淋巴细胞的增殖功能及IL-2分泌水平等指标均较同剂量X射线照射组明显增高。表明补充胶原蛋白肽可以使X射线照射小鼠的免疫功能得到一定程度的恢复。但600 mg/kg体重的胶原蛋白肽不能使这些指标恢复到健康对照组水平，免疫功能的恢复可能需要较长的时间或较大剂量的胶原蛋白肽。在今后的研究工作中，可以考虑与其他免疫调节剂联合应用或适当延长胶原蛋白肽的使用时间，可能对于免疫功能的恢复有所帮助。
补充胶原蛋白肽可以使X射线照射小鼠的免疫功能有一定程度的恢复，但作用机制尚不清楚，胶原蛋白中含有多个生物活性基团，有可能通过直接或借助其他生物活性分子间接的发挥作用，有关机制尚需进一步研究。
利益冲突 所有作者无任何利益冲突作者贡献声明 宋淑军、司少艳负责论文设计、实验操作、数据分析、论文撰写；刘俊丽负责论文的设计、实验操作；左晓勇、王莹、单改仙负责实验的操作、数据的初步统计和分析；郭燕川负责实验数据的分析、论文修改；王宗烨负责实验设计、数据的分析、论文撰写及修改
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