目前放疗仍然是肺癌重要的治疗手段，而放射抗拒是导致放疗后局部肿瘤复发和远处转移最重要的原因。Toll样受体家族(TLRs) 是沟通天然免疫和获得性免疫的天然模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，在识别和抵御各种病原微生物感染中发挥着重要作用；而越来越多研究表明，TLR9在多数肿瘤组织中表达增高，并且TLR9信号通路的激活参与了肿瘤的发生发展和侵袭的过程，并且影响着肿瘤治疗的结果。在本组前期研究中已经证实肺癌组织TLR9高表达，并且TLR9表达增高与肺癌患者术后放疗生存相关，在此基础上本研究通过靶向干扰RNA技术旨在探讨抑制TLR9表达对R-A549细胞辐射敏感性的影响。

1. 实验试剂及材料:改良型RPMI 1640培养基（美国赛默飞公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；靶向TLR9 siRNA及阴性对照siRNA[(美国 SANTA CRUZ公司) TLR9siRNA(h):sc-40270，siRNA-A:sc-37007]，转染试剂Lipofec-tamine^TM 2000、无抗培养基Opti-MEM（美国Invitrogen公司）；兔源TLR9单抗和鼠源GAPDH单抗（美国Abcam公司）；FITC细胞周期PI试剂（美国 BD phamingen公司）。

2. 放射抗拒肺癌A549细胞制备：人肺癌细胞株A549由复旦大学附属肿瘤医院馈赠，以10%小牛血清+改良型RPMI 1640培养，置于37℃、含5%的CO₂培养箱中，0.25%胰酶消化传代，取2～3代对数生长期细胞进行R-A549细胞制备和实验。采用本组前期研究方法制备R-A549细胞^[1]，瑞典Elekta直线加速器，6 MV X射线照射，源靶距100 cm，吸收剂量率2 Gy/min，6.37 Gy/次，共照射10次，每次照射后更换1次培养基，之后根据细胞贴壁生长状态，2～3 d再次更换培养基，细胞传5代以内且贴壁达80%左右再次照射，直到完成10次照射，完成R-A549细胞制备。

3. R-A549细胞培养及siRNA转染：R-A549细胞于RPMI 1640培养基、10%胎牛血清置于37℃、5%的CO₂培养箱培养传代，取其1～2代对数生长期细胞进行siRNA转染。将稳定生长的对数期R-A549细胞以3.5×10⁵/孔接种于6孔板，以RPMI 1640培养基、10%胎牛血清继续培养，待其贴壁生长达50%～70%时进行转染；按照说明分别以60、80和100 μmol/L的转染终浓度进行实验，取相应量TLR9 siRNA和对照siRNA分别与Lipofectamine^TM 2000混合形成转染复合物，将转染复合物加入无抗培养基Opti-MEM至2 ml/孔，再加入6孔板轻轻混匀进行细胞转染，期间置于37℃、5%的CO₂培养箱6 h，后换液RPMI 1640培养基、10%胎牛血清继续培养；48 h后进行蛋白抽提，验证TLR9siRNA转染抑制效率，确定转染终浓度为80 μmol/L；细胞照射安排在转染24 h后进行，照射剂量10 Gy，6 MV X射线单次照射。

4. 实验细胞分组及其TLR9表达：将A549细胞(A549)、R-A549细胞(R-A549)、阴性siRNA转染细胞、TLR9 siRNA转染4组细胞作为实验对象。Western blot验证其TLR9表达。于细胞转染48 h后，冰上裂解细胞，超声破碎进行蛋白抽提，二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度，之后进行蛋白变性处理。SDS-PAGE分离胶为5%～10%的梯度胶，为等体积加样，每加样孔上样量为10 μl，80 V恒压电泳至marker开始分离时改为120 V恒压电泳到底；以100 V恒压湿法转膜60 min，10%牛奶（脱脂奶粉+TBST+0.1%吐温-20）室温摇床封闭4 h，1×TBST清洗3次，每次10 min，一抗（兔源TLR9单抗、鼠源GAPDH抗体：abcam）4℃孵育过夜；第2天弃去一抗，1×TBST洗膜3次，每次10 min，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育1 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化学显色（A液∶B液=1∶1），暗室曝光显影图像处理。

5.各实验组照射前后细胞活力的测定:siRNA转染24 h后分别取4个实验组的对数生长期细胞，以每孔3 000个细胞接种于96孔板，各组设3个复孔，以PBS作为空白对照，培养24 h后，加入10 μl/孔 CCK-8试剂，振匀后避光培养2 h，上酶标仪测其吸光度（A_{450 nm}）值；照射组实验细胞进行6 MV X射线照射10 Gy，继续培养24 h后加入CCK-8试剂，避光2 h后上酶标仪检测各组细胞活力。细胞存活率（%）=siRNA转染细胞平均A_{450 nm}/R-A549细胞平均 A_{450 nm}×100%。

6. 转染细胞克隆集落形成实验:将指数生长期R-A549细胞和转染组细胞，接种于6孔板（每孔3.5×10⁵个细胞），培养24 h后分别给以0、2、4、6和8 Gy 6 MV X射线照射细胞，照射后立即用胰酶消化细胞，吹打成细胞悬液，分别接种于培养皿（每皿接种1 000个细胞）中，培养14 d，中间更换培养液1次。之后磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2遍，甲醇固定2 h，姬姆萨染色，计数细胞集落（含50个细胞以上）；计算集落形成率（PE,%）=集落数/接种细胞数×100%，细胞存活分数（SF）=处理组PE/空白对照组PE。

7. siRNA转染细胞照射前后细胞周期检测：R-A549细胞、阴性siRNA转染细胞和TLR9 siRNA转染细胞完成以上处理并培养24 h后，进行6 MV X射线源靶距100 cm照射，照射剂量10 Gy后换液继续培养24 h，胰酶消化和收集各组细胞，预冷PBS洗3次，预冷的70%乙醇固定于-20℃ 2 h以上；室温1 000 g离心5 min，去上清，PBS洗1次，吸去上清，加入细胞周期试剂PI（50 μg/ml）重悬细胞，避光4℃静置20 min，上流式细胞仪检测。对siRNA转染细胞和R-A549细胞不予 X射线照射，同期流式细胞周期检测。

8. 统计学处理：计量资料以x±s表示。数据分析采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析；应用GraphPad Prism5.0软件进行统计图形制作。 P<0.05为差异有统计学意义。

1. Western blot检测各组细胞TLR9表达结果：对肺癌A549细胞和R-A549细胞以及转染siRNA后各实验组细胞TLR9蛋白Western blot检测，结果见图 1，R-A549细胞比A549细胞TLR9的表达水平增高,差异有统计学意义（t=5.429，P<0.05），TLR9siRNA转染细胞TLR9表达水平较R-A549细胞降低，其TLR9表达水平为R-A549细胞的38%，二者比较差异有统计学意义（t=8.549，P<0.05）。

图 1 4组实验细胞TLR9蛋白Western blot检测结果 Figure 1 TLR9 expressions in A549,R-A549,TLR9-siRNA transfected R-549 and its negative control R-A549 cells

2. siRNA转染R-A549细胞克隆集落形成： A549细胞、R-A549细胞、阴性siRNA转染细胞、TLR9 siRNA转染细胞给予0、2、4、6 和8 Gy照射后进行细胞存活分数对比，结果显示，2、4、6和8 Gy照射后A549细胞、阴性siRNA转染细胞、TLR9 siRNA转染细胞存活分数均低于R-A549组细胞；经过单击多靶模型曲线拟合（图 2），计算得到4组细胞D₀、D_q、N值，结果见表 1，其中A549细胞和TLR9 siRNA转染细胞较R-A549细胞有较低的D₀、D_q和N值，阴性siRNA转染细胞较R-A549细胞D₀值增高，根据放射增敏比公式计算得到A549细胞、阴性siRNA转染细胞和TLR9 siRNA转染细胞相对于R-A549细胞的放射增敏比（SER_D0）,分别为1.09、0.90和1.37。

图 2 各实验组细胞集落形成结果 Figure 2 Cloning survival of A549,R-A549,TLR9-siRNA transfected R-549 and its negative control R-549 cells

表 1(Table 1)

表 1 4组实验细胞放射增敏比比较 Table 1 SERD0 of A549,R-A549,TLR9-siRNA transfected R-549 and its negative control R-549 cells 组别 D0 Dq N SERD0 R-A549组 3.381 4.207 3.471 － A549组 3.114 2.645 2.338 1.09 阴性siRNA转染组 3.747 3.039 2.250 0.90 TLR9 siRNA转染组 2.462 2.154 2.399 1.37 注：D0.平均致死剂量，Dq.准阈剂量，N.细胞内所含的放射敏感靶数；SERD0.照射R-A549细胞的D0值与其他3组照射D0值的比值

表 1 4组实验细胞放射增敏比比较 Table 1 SERD0 of A549,R-A549,TLR9-siRNA transfected R-549 and its negative control R-549 cells

3. 实验组细胞活力测定： 对4组实验细胞进行细胞增殖能力测定，结果见表 2，与R-A549细胞相比，给予0 Gy照射时，阴性siRNA转染细胞和TLR9 siRNA转染细胞活力增加，照射10 Gy后A549细胞、阴性siRNA转染细胞和TLR9 siRNA转染细胞活力较0 Gy照射降低，照射前后A549细胞、阴性siRNA转染细胞和TLR9 siRNA转染细胞增殖能力变化差异均有统计学意义 (t=3.041、4.077和8.410，P<0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 X射线照射对各组细胞活力的影响（A值，x±s） Table 2 Effect of 10 Gy X-ray radiation on the viability of A549,R-A549,TLR9-siRNA transfected R-549 and its negative control R-549 cells (A,x±s) 照射剂量(Gy) 样本数 A549 R-A549 阴性siRNA转染 TLR9siRNA转染 0 3 0.979±0.082 1.000±0 1.357±0.150 2.125±0.178 10 3 0.662±0.047 1.000±0 0.933±0.039 1.250±0.255 t值 3.041 0.000 4.077 8.41 P值 <0.05 >0.05 <0.05 <0.05

表 2 X射线照射对各组细胞活力的影响（A值，x±s） Table 2 Effect of 10 Gy X-ray radiation on the viability of A549,R-A549,TLR9-siRNA transfected R-549 and its negative control R-549 cells (A,x±s)

4.siRNA转染细胞周期分布检测结果: 对R-A549细胞、阴性siRNA转染细胞和TLR9 siRNA转染细胞进行10 Gy照射前后的流式细胞周期检测，结果见表 3。R-A549细胞、TLR9 siRNA转染细胞照射后，G₂/M和S期细胞均比照射前增加；而G₁/G₀期细胞则比照射前减少；阴性siRNA转染细胞照射前后表现为G₂/M期细胞分布降低，G₁/G₀期细胞分布增加。进一步对比照射后siRNA转染细胞和R-A549细胞周期分布，发现TLR9 siRNA转染细胞G₂/M和S期分布较R-A549细胞均增加（t=4.323、6.499，P<0.05)，G₁/G₀期细胞分布较R-A549细胞减少，差异有统计学意义（t=7.616，P<0.05）；阴性siRNA转染细胞则表现为G₂/M期、S期细胞分布低于R-A549细胞，G₁/G₀期细胞分布增加。

表 3(Table 3)

表 3 siRNA转染R-A549细胞照射前后各组细胞周期分布（x±s） Table 3 The cell cycle distribution of TLR9-siRNA transfected R-A549 cells before and after irradiation（x±s） 组别 样本数 G2/M期 G1/G0期 S期 照射前 照射后 照射前 照射后 照射前 照射后 R-A549组 3 3.86±3.40 9.89±1.33 81.80±4.39 66.60±2.12 14.37±2.21 23.50±3.47 阴性siRNA转染组 3 3.74±1.90 2.06±3.57a 83.63±2.50 85.80±4.10a 12.60±1.91 12.13±0.67a TLR9siRNA转染组 3 6.28±0.42 15.40±0.53a 78.63±2.06 50.00±0.36a 15.10±2.34 34.63±0.85a F值 1.202 27.39 1.936 135.1 1.061 86.25 P值 0.36 <0.05 0.22 <0.05 0.4 <0.05 注：与同细胞周期照射后的R-A549比较，at=3.042、4.323，8.809、7.616，6.635、6.499，P<0.05

表 3 siRNA转染R-A549细胞照射前后各组细胞周期分布（x±s） Table 3 The cell cycle distribution of TLR9-siRNA transfected R-A549 cells before and after irradiation（x±s）

已知TLR9受体在树突状细胞(pDC) 和B细胞中高表达，细菌和病毒DNA中的非甲基化CpG DNA作为其配体，通过激活TLR9信号通路pDC可产生大量的I型IFNs，发挥直接和/或间接的细胞毒作用，并刺激B细胞大量增殖，同时促进IgM分泌^[2-3]，在识别和抵御各种病原微生物感染中发挥着重要作用；而现在越来越多的研究^[4-6]表明，TLR9也在多种实体肿瘤中表达增高，参与了肿瘤的产生、侵袭和转移过程，不仅与肿瘤的临床分期相关，也影响着肿瘤治疗的结果。

放射治疗是肺癌最常用的治疗方法，常规分割照射“4R”理论—肿瘤细胞再氧合、细胞周期再分布、照射后期细胞再增殖和再群体化贯穿于放射治疗的全过程，这一过程中部分肿瘤细胞成为放射耐受细胞，进一步克隆增殖后产生放射抗拒^[7]。而进一步研究证实，电离辐射诱导激活了一系列的信号分子和通路，诸如细胞周期调控、DNA损伤与修复、细胞凋亡、癌基因与抑癌基因、细胞代谢等过程，有结果显示受到照射的肿瘤细胞60多种基因的表达上调^[8]，导致细胞粘附、肿瘤血管生成增加，利于肿瘤的侵袭和转移，产生肿瘤的放射抗拒。已知TLR9被相应配体激活后，分别激活核转录因子AP-l、NF-kB和Stat1，一方面诱导各类细胞增殖因子合成而促进肿瘤的生长，另一方面促进炎症介质TNFα、IL-1、IL-6、IL-8等合成增加，引起促炎症免疫反应或抑炎症免疫反应，参与肿瘤微环境的形成^[9]； Ren等^[10]Xu等^[11]研究证实，肺癌细胞TLR9信号通路激活能上调炎性因子、MMP-2（基质金属蛋白酶）和趋化因子受体水平，同时又促进免疫抑制因子IL-10的分泌，最终导致肿瘤细胞显著增殖，从而增加了肿瘤细胞侵袭和转移的能力。本组的前期研究中通过免疫组织化学证实肺癌组织中TLR9表达增高，而正常肺泡细胞中TLR9并无表达，肺癌组织TLR9表达增高的水平与肿瘤直径、淋巴结有无转移呈正相关，且TLR9表达与肺癌术后放疗的生存相关^[12]；因此，本研究利用前期研究的TLR9表达增高的放射抗拒肺癌A549细胞作为研究对象，通过siRNA脂质体转染技术，探讨抑制其TLR9表达对辐射治疗结果的影响。

本组前期对CpG ODN7909的辐射增敏研究发现^[1]，放射抗拒肺癌A549（R-A549）细胞TLR9表达明显增高，细胞倍增时间明显延长，辐射敏感性下降。本研究沿用了前期制备R-A549细胞的实验方法，并经Western blot证实R-A549细胞TLR9表达高于A549细胞；采用脂质体转染技术将TLR9 siRNA及阴性 siRNA对R-A549细胞进行瞬时转染并予以TLR9表达的验证，TLR9 siRNA转染组细胞呈现出TLR9蛋白的低水平表达，为后续的辐射增敏研究奠定基础。国内有研究者通过RNA干扰技术抑制MDC1蛋白表达，对放射线诱导食管癌细胞ECA109克隆形成率下降有促进作用^[13]。本研究通过细胞克隆集落形成实验也得出类似结果。转染TLR9 siRNA组R-A549细胞照射后细胞克隆形成率低于R-A549细胞和A549细胞，转染阴性 siRNA组R-A549细胞照射后克隆形成与R-A549细胞克隆集落形成相差不大，经过单击多靶模型拟合，结果A549细胞和转染TLR9 siRNA组细胞均较R-A549细胞有较低的D₀、D_q、N值，二者的放射增敏比分别为1.09和1.37，而转染阴性 siRNA组细胞较R-A549细胞D₀值增高，D_q、N值降低，二者的放射增敏比为0.90；说明通过靶向siRNA抑制R-A549细胞TLR9表达，能够降低R-A549照射后的克隆集落形成率，具有放射增敏的作用。

进一步对siRNA转染细胞照射前后的细胞周期分布进行分析，结果显示，照射后R-A549组和TLR9 siRNA转染组细胞的G₂/M期分布均较照射前增多，而G₁/G₀期细胞分布照射后二者均减少；其中照射后TLR9 siRNA转染组细胞的G₂/M期分布比R-A549组明显增多，显示出TLR9 siRNA转染组细胞较R-A549细胞照射后有更多细胞阻滞在G₂/M期；已有研究证实DNA损伤后细胞周期激酶立即被激活，通过激活下游调节通路，主要调节S期和/或G₂/M期检测点^[14]。周福祥等^[15]发现放射抗拒细胞Hep-2R有CDC25基因下调，导致G₂/M期细胞减少，而CDC25B基因主要是调节细胞向G₂/M期转化，因此，本研究中TLR9 siRNA转染组细胞照射后发生G₂/M期阻滞意味着放射敏感性的提高；同时照射后TLR9 siRNA转染组细胞的G₁/G₀期分布比R-A549组明显减少，也有效抑制了放疗后肿瘤细胞的潜在致死性损伤修复能力，也利于R-A549细胞放射敏感性的提高。本研究结果显示TLR9 siRNA转染细胞照射后S期细胞分布明显高于R-A549细胞，而S期细胞是对放射线最不敏感。

综上所述，本研究通过靶向干扰RNA方法成功抑制了R-A549细胞TLR9表达水平，降低了R-A549细胞的克隆形成，而且通过抑制TLR9表达使其放疗后发生G₂/M期细胞阻滞并减少G₁/G₀期细胞分布。因此，具有辐射增敏的作用,为肺癌放疗效果预测或放疗增敏提供了新的思路。