随着核能及辐射技术在工业、农业、医学和国防等诸多领域的应用，寻找有效的辐射防护药物以应对核与辐射突发事件及医疗事故中的放射损伤是十分重要的研究课题^[1-2]。普罗布考(probucol)是目前临床应用中抗氧化作用最强的人工合成抗氧化剂，具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用^[3]。然而，严重的不良反应(如胃肠道反应、头痛、头晕、失眠、耳鸣等)限制了其在临床中的应用。本研究拟构建一个生物相容性的仿细胞膜结构的聚合物胶束，对疏水性的普罗布考进行有效的包载，探究其是否能够降低药物的不良反应，并增强其辐射防护作用。

一、 材料与方法

1.药品与试剂：壳聚糖(chitosan, 50 000 g/mol)购于浙江金壳生物化学有限公司；2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)、普罗布考(probucol)，以及1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购于美国Sigma-Aldrich公司；牛胎血清(FBS)和杜氏培养液(DMEM)购于美国Logan公司；盐酸、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)购于上海国药集团。

2.细胞与照射：人成纤维细胞(HDF)购于苏州海吉亚生物科技有限公司。X射线源由苏州大学辐照中心提供，吸收剂量率为1.24 Gy/min，源靶距45 cm。

3.聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱辐照接枝壳聚糖共聚物(CS-g-PMPC)的合成：在10 ml的安培瓶中加入MPC(0.1 g)、chitosan(0.12 g)以及S, S′-双(α，α′-二甲基-α′-乙酸)三硫代碳酸酯(BDACT, 0.021 2 g)，加入8 ml的丙酮和1% HCl混合溶剂(V:V=3:7)，搅拌使其充分溶解。通氩气20 min后熔融封管，用⁶⁰Co源照射16.7 h，剂量率为10 Gy/min。结束后，用去离子水透析瓶内混合物。将透析液冷冻干燥后得到接枝共聚物CS-g-PMPC。用核磁共振氢谱(¹HNMR)和红外光谱(FT-IR)表征聚合物的结构。

4.普罗布考包载到共聚物纳米颗粒：普罗布考50 mg溶于乙醇2.0 ml中，滴入CS-g-PMPC的水溶液(1.61 mmol/L, 20 ml), 并剧烈搅拌。在混合液中通入氩气过夜, 以除去乙醇，然后将得到的悬浮液以8 000 r/min离心20 min，离心半径为4.5 cm，取上清液冷冻干燥，即可得到CS(probucol)-g-PMPC药物纳米颗粒。

5.载药率的测试：称取3.0 mg的CS(probucol)-g-PMPC药物纳米颗粒，分散在3.0 ml的乙醇中，避光超声8 h之后，抽滤过孔径为0.22 μm的有机滤膜，以除去CS-g-PMPC载体。乙醇中普罗布考的浓度可通过紫外光谱来测定，首先测得溶液在243 nm处的吸光度，然后，根据作出的标准曲线计算出普罗布考的质量。普罗布考的载药率(LE，wt%)计算公式如下：LE=W_probucol/W_CS-g-PMPC × 100%。式中，W_probucol为计算得到的普罗布考质量，W_CS-g-PMPC为CS-g-PMPC载体质量。

6.体外CS(probucol)-g-PMPC药物纳米颗粒的释放实验：将5 mg的药物纳米颗粒分散在5 ml的PBS(pH7.4)溶液中，将其置于截留分子量(MWCO)=3 500的透析袋内。将透析袋放置在25℃和37℃的PBS缓冲溶液中，在搅拌中进行透析释放。PBS缓冲溶液中普罗布考的量通过紫外分光光谱测得313 nm处的吸光度，再根据作出的标准曲线计算质量。

7. DPPH自由基清除实验测试体外药物纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC的抗氧化活性：按文献[4]方法，首先称取1.0 mg的DPPH，溶解在25 ml的乙醇中，超声振荡，配成0.1 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液。随后配样品液，浓度分别为1.45 mmol/L的普罗布考，1.45 mmol/L的载体CS-g-PMPC和1.45 mmol/L的药物纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC。将样品液分别加入到2 ml上述的DPPH自由基乙醇溶液中，避光振荡反应8 h。接着，在紫外分光光度计上测得反应后溶液的吸收值。DPPH吸光度的减少值可以用来计算自由基的清除效率，计算公式如下：DPPH吸光度减少值(%)=100%-A_样品/A_对照× 100%。其中，A_样品和A_对照分别为样品液和空白对照组的吸光度。

8.药物纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC的细胞毒性实验：按文献[5]方法，在DMEM培养基中加入10%的FBS，37℃下培养HDF细胞。计数调整细胞浓度为5×10³/ml，按照200 μl/孔的剂量接种于96孔板中，待细胞贴壁后，吸出培养基，并换成含有不同药物probucol、CS-g-PMPC和CS(probucol)-g-PMPC的培养基，每组均设置5个平行孔。在37℃、5%CO₂密度的潮湿的空气中培养过夜。培养结束后，用PBS溶液洗96孔板1次，然后，加入1.2 mmol/L 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的DMEM溶液在37℃培养4 h，随后每孔加入150 μl的DMSO。用酶标仪在590 nm处测定每孔的吸光度。除去空白值，计算每组处理后的细胞活力百分比值。

9.药物纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC的辐射防护实验：按上述方法，培养HDF细胞，并将细胞置于剂量率为1.24 Gy/min的X射线下照射6 Gy。之后于培养箱中培育细胞48 h。最后，用PBS溶液洗涤96孔板1次，然后加入1.2 mmol/L MTT的DMEM溶液在37 ℃培养4 h，随后每孔加入150 μl的DMSO。用酶标仪在590 nm处测定每孔的吸光度。除去空白值，计算每组处理后的细胞活力百分比值。

10.统计学处理：所有实验均重复3次，数据以x±s表示。采用SPSS 17.0软件进行分析，组间比较用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

二、 结果

1.壳聚糖接枝聚合物合成及普罗布考药物装载研究：通过亲疏水的相互作用，普罗布考药物可以被包载进接枝共聚物CS-g-PMPC纳米颗粒的疏水内核中，包载率为(25.44±2.41)%。同时，考察载药纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC在PBS溶液中的释放行为，8 h之后释放趋于稳定。体外抗氧化活性研究表明，单纯的载体CS-g-PMPC不具有抗氧化活性；相比之下，CS(probucol)-g-PMPC药物纳米颗粒表现出了较高的自由基清除效率，且随着药物浓度升高，清除效率迅速上升。当药物浓度在580 μmol/L时，CS(probucol)-g-PMPC药物纳米颗粒的自由基清除效率与单一普罗布考清除效率相当，预期具有良好的辐射防护效果。

2.载药纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC的细胞毒性：从表 1可以看出，当普罗布考的浓度高达500 μmol/L以上时，细胞的存活率降低为50%左右；与此相反的是，当用500 μmol/L的药物纳米颗粒处理细胞后，细胞存活率高达90%以上(t=-11.388, P < 0.05)。这一结果表明, 普罗布考对细胞有较大的毒性，而药物纳米颗粒可降低其细胞毒性。此外，当用共聚物纳米颗粒处理细胞后，细胞活力变化不大，这可能和聚合物的生物相容性密切相关。MTT结果表明，生物相容性的接枝共聚物CS-g-PMPC可以为普罗布考提供一个低毒的载体。

3.载药纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC的体外辐射防护效应：表 2给出了药物纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC的辐射防护效果。鉴于药物进入细胞需要一定的时间，而且药物必须在细胞内达到一定的浓度才能表现出辐射防护的效果，因此，使用不同浓度的药物[CS-g-PMPC, probucol和CS(probucol)-g-PMPC]处理HDF细胞12 h之后，细胞受照6 Gy后存活率有一定程度降低，约为65%。在一定的浓度范围内，当用药物普罗布考处理HDF细胞之后，起到了辐射防护的效果，细胞的存活率较未处理组明显增多(t=-2.915, -2.277, -4.943, P < 0.05)；然而，当浓度高达400 μmol/L时，细胞活力骤然下降(t=5.291, 4.231, P < 0.05)，这可能与药物的细胞毒性密切相关。相比之下，随着载药纳米颗粒CS(probucol)-g-PMPC的浓度增加，其所产生的辐射防护效果持续增强(t=-2.932, -3.299, -4.350, P < 0.05)。结果表明壳聚糖接枝聚合物纳米载体可以显著增强普罗布考的辐射防护效果。

三、 讨论

近年来，人为活动引起的辐射水平的升高受到重视^[6]。其中，核技术的快速发展以及应用引起了环境中放射性水平的升高^[7]。当电离辐射的高能射线照射人体时，能够产生大量的自由基，自由基可以破坏细胞的酶结构^[8-10]，导致DNA的双链断裂^[11]，扰乱细胞的正常功能，引起机体器官和组织的损伤^[12-14]。因此，寻找有效的辐射防护药物以抵抗电离辐射危害具有重要意义^[15]。

迄今为止，国内外的学者们对辐射防护试剂做了大量的研究，但是还存在较多的局限性，如细胞毒性高、溶解度低、半衰期短等，无法满足临床需求^[16]。本课题组首次提出将具有长循环性能的纳米载体用于包载辐射防护药物，解决了其在应用中的半衰期短以及溶解度差的缺点，提高了药物的辐射防护效果^[17]。这一尝试为辐射防护药物的临床应用开辟了一个新的途径。

本研究中，利用生物相容性的壳聚糖为基材，辐射接枝具有类细胞膜结构的PMPC聚合物用作纳米药物载体。首先，在γ射线的辐照下将PMPC接枝到壳聚糖上，合成得到共聚物CS-g-PMPC，其在水溶液中可以自组装形成具有核壳结构的纳米胶束。抗氧化剂普罗布考通过疏水作用与CS-g-PMPC纳米胶束相互结合，进入到纳米颗粒的核内。药物纳米颗粒在PBS溶液中可以稳定存在，均匀分散，没有出现团聚现象。在普罗布考浓度高达500 μmol/L时，单纯的药物具有一定的细胞毒性，而载药纳米颗粒没有表现出明显的毒性。随着药物浓度增加，载药纳米颗粒的辐射防护效果也逐渐增强；相比之下，由于普罗布考具有较大的细胞毒性，单一药物普罗布考处理组的细胞活力明显减少。研究结果表明聚合物纳米载体包载普罗布考辐射防护药物，可以显著降低药物不良反应，提高辐射防护效果，在临床上具有良好的应用前景。

致谢: 感谢苏州大学大学生创新创业训练计划项目和江苏省普通高校学术学位研究生创新计划项目资助
利益冲突 本人与本人家属、其他研究者，未因进行该研究而接受任何不正当的职务或财务利益，在此对研究的独立性和科学性予以保证
作者贡献声明 董萍和张惠军对本文具有同等的贡献，参与实验设计、数据分析，并起草和修改论文，负责纳米药物载体的合成、载药实验及抗氧化性能研究；华松负责细胞部分实验；刘芬菊对部分数据参与了科学讨论；陈茜参与了纳米药物制备及细胞部分实验；华道本负责总体方案设计、数据分析和论文撰写指导