2016, Vol. 36
在人类基因组序列中超过90%的序列能够被转录为RNA，仅有约2%的RNA能编码蛋白质，其余均为非编码 RNA(ncRNA)。其中大部分是长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA(lncRNA)[1]。人长链基因间非编码RNA-p21(lincRNA-p21)位于细胞周期调节基因p21上游约15 kb处，包含2个外显子，长度约3.0 kb。研究证实，lincRNA-p21在多种类型的肿瘤中均表 达下调，能被细胞中DNA损伤信号激活[2]。目前研究发现，在乏氧环境中乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)能诱导lincRNA-p21表 达，使lincRNA-p21参与调控乏氧肿瘤细胞的多种生物学功能，包括促进其糖酵解和Warburg效应[3]。本实验选取人肝癌和脑胶质瘤细胞系，研究lincRNA-p21的乏氧诱导表 达规律，探讨敲低 lincRNA-p21对乏氧肿瘤细胞放射敏感性的影响及其机制。
1. 细胞系：人肝癌细胞SMMC7721(p53野生型)，人脑胶质瘤细胞U251MG(p53突变型)，冻存。
2. 试剂：DMEM高糖培养基、PBS缓冲液购于美国Hyclone公司。胎牛血清购于兰州华烨生物有限公司。胰酶购于美国GIBCO公司。TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司。合成cDNA试剂盒购于美国Thermo公司。实时荧光定量PCR(QRT-PCR)试剂盒购于上海吉玛制药技术有限公司。细胞周期检测试剂盒购于美国Vazyme公司。细胞凋亡检测试剂盒购于美国SouthernBiotech公司。兔抗人HIF-1α和GLUT1单克隆抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG购于美国Santa Cruz公司。
3. 细胞培养：SMMC7721、U251MG细胞均用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，常氧条件下在恒温37℃，5%CO2的培养箱中培养，乏氧条件下在恒温37℃，1%O2，5%CO2，94%N2的培养箱中培养。用0.25%的胰酶消化，2～3 d传代1次。
4. 照射条件：美国Rad Source公司RS-2000 Pro X射线照射机，剂量率为1.23 Gy/min，源靶距40 cm。经2、4、6、8 Gy剂量X射线照射，置于恒温37℃、5%CO2培养箱中培养。
5. 慢病毒载体构建：含lincRNA-p21 siRNA序列(5′ CTGCAAGGCCGCATGATGA 3′)的穿梭质粒和包装质粒(pGap/Pol、pRev、pVSV-G)由上海吉玛制药技术有限公司构建制备。接种293T细胞于15 cm培养皿中培养过夜，按比例加入穿梭质粒和包装质粒共转染293T细胞，6 h后弃去转染液，加入细胞培养液继续培养。收集转染后72 h的293T细胞上清液，于4℃、4 000×g离心4 min以去除细胞碎片，0.45 μm过滤器过滤后，25 000×g离心2 h，以预冷的PBS液重悬病毒沉淀，病毒液命名为LV-anti-lincRNA-p21，-80℃保存。病毒液10倍稀释3～5个梯度，转染293T细胞，荧光显微镜计数荧光细胞计算病毒滴度。
6. 稳定转染细胞克隆筛选：将细胞系SMMC7721、U251MG接种到24孔板中，待细胞融合率达到50%时，分别加入100和20 μl慢病毒原液，按终浓度5 μg/ml加入Polybrene试剂增强感染效率，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后移去细胞浸染后的病毒液，加入完全培养液继续培养。感染72 h后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)。 以终浓度为1 μg/ml的嘌呤霉素对感染后的细胞系进行稳定转染筛选，待细胞贴满培养皿底即传代，持续4周。实验分两组，阴性对照组和转染组。
7. 实时荧光定量PCR实验：取对数生长期的细胞，用TRIzol试剂消化细胞并提取细胞总RNA，测定RNA浓度。用cDNA合成试剂盒将总RNA反转录成cDNA，反转录反应条件为25℃，5 min；42℃，60 min；70℃，5 min。用定量PCR试剂盒检测分析lincRNA-p21表 达变化情况。lincRNA-p21上游引物为5′ GGGTGGCTCACTCTTCTGGC 3′，下游引物为5′ TGGCCTTGCCCGGGCTTGTC 3′。内参GAPDH上游引物为5′ AGCCACATCGCTCAGACAC 3′，下游引物为5′ GCCCAATACGACCAAATCC 3′。定量PCR反应程序为95℃，3 min；95℃，12 s；62℃，40 s；40个循环。对照组目的基因表 达量为1，处理组目的基因相对表 达量用2-ΔΔt表 示。
8. 流式细胞仪检测细胞周期实验：取转染组和阴性对照组对数生长期细胞SMMC7721和U251MG，在乏氧(1%O2)条件下培养48 h。每管收集3×106细胞，用冷PBS洗涤后缓慢滴加1 ml冰冷的75％乙醇，静置于4℃固定过夜。上机前，4℃ 1 000×g 5 min离心收集细胞。冷PBS洗涤 细胞，400 μl冷PBS重悬细胞。加入20 μl RNase A溶液，37℃水浴30 min。400目筛网过滤，加入400 μl PI染液混匀，4℃避光孵育60 min。流式细胞仪检测细胞周期，每个实验组设3个平行样。
9. 流式细胞仪检测细胞凋亡实验：取转染组和阴性对照组对数生长期细胞，在乏氧(1%O2)条件下培养48 h。冷PBS洗涤细胞2次，每管收集5×105细胞于100 μl染色缓冲液中。加入10 μl Annexin V-PE混匀，冰上避光孵育15 min，加入380 μl染色缓冲液，10 μl 7-AAD。流式细胞仪检测细胞凋亡，每个实验组设3个平行样。
10. 克隆形成实验：取对数生长期细胞，分别接种2×102、4×102、4×102、1×103、2×103细胞到6孔板中，培养24 h后经0、2、4、6和8 Gy X射线照射，每组3个样本，照射后继续培养14 d，弃去培养液，PBS洗2次。每孔加2 ml甲醇固定15 min，吸去甲醇，加2 ml结晶紫溶液染色30 min。在水中轻漂去色，烘箱干燥30 min，显微镜下计数>50个细胞的克隆数。以每次实验的0 Gy组计算克隆形成率，克隆形成率(PE,%)＝克隆数/接种细胞数×100％，存活分数(SF)=克隆数/接种细胞数×克隆形成率。在GraphPad Prism 5软件中使用多靶单击模型计算放射生物学参数并拟合剂量存活曲线。
11. Western blot检测蛋白表 达：乏氧培养48 h收获细胞，用单去污剂裂解法提取总蛋白，每个样品取30 μl进行SDS-PAGE电泳分离。电泳完成后，通过半干式转移电泳槽将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜(NC)上。转移结束后，将NC膜在含3%脱脂奶粉的PBS中室温封闭2 h，用单克隆抗体进行杂交，洗膜，暗室曝光。
12. 统计学处理：数据用±s表 示。采用SPSS 19.0软件进行分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
1. 乏氧促进lincRNA-p21的表 达：对数生长期细胞SMMC7721、U251MG在乏氧(1%O2)条件下培养24和48 h，经QRT-PCR检测lincRNA-p21相对表 达量，SMMC7721细胞24、48与0 h组相比，lincRNA-p21表 达明显升高(t=5.13、7.49，P＜0.05)。U251MG细胞24、48与0 h组相比，lincRNA-p21表 达明显升高(t=8.90、10.11，P＜0.05)。SMMC7721、U251MG细胞48与24 h组相比，lincRNA-p21表 达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。结果表 明，乏氧上调lincRNA-p21的表 达，且随乏氧培养时间逐渐增加(表 1)。
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表 1 QRT-PCR检测乏氧不同时间lincRNA-p21
表 达的变化( ±s)
Table 1 The expression of lincRNA-p21 detected by QRT-PCR at different time intervals of hypoxia treatment(±s) |
2. 稳定转染lincRNA-p21反义寡核苷酸下调乏氧肿瘤细胞中lincRNA-p21的表 达：稳定转染lincRNA-p21反义寡核苷酸敲低乏氧肿瘤细胞中lincRNA-p21，嘌呤霉素筛选4周后，2种细胞转染效率均达到90%以上，见图 1。转染组与阴性对照组对数生长期细胞SMMC7721、U251MG在乏氧条件下(1%O2)培养48 h，经QRT-PCR检测lincRNA-p21相对表 达量，SMMC7721、U251MG细胞转染组与阴性对照组相比，lincRNA-p21相对表 达量分别为0.076±0.011和0.055±0.005，表 达明显下调 (t=144.81、334.32，P＜0.05)。结果表 明，稳定转染lincRNA-p21反义寡核苷酸能有效下调lincRNA-p21在乏氧肿瘤细胞中的表 达。
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图 1 荧光显微镜下观察转染lincRNA-p21反义寡核苷酸96 h后肿瘤细胞转染效率 A. SMMC7721细胞绿色荧光；B. U251MG细胞绿色荧光；C. SMMC7721细胞明场；D. U251MG细胞明场 Figure 1 The efficiency of lincRNA-p21 antisense oligonucleo-tides transfer in tumor cells at 96 h after transfection A. SMMC7721 cells green fluorescence; B. U251MG cells green fluorescence; C. SMMC7721 cells bright-field; D. U251MG cells bright-field |
3. 敲低lincRNA-p21阻滞乏氧肿瘤细胞周期：转染组和阴性对照组对数生长期细胞SMMC7721、U251MG乏氧(1%O2)培养48 h，流式细胞仪检测细胞周期，G2/M期比例明显升高，差异有统计学意义(t=7.05、10.18，P＜0.05)。说明敲低lincRNA-p21诱导细胞在G2/M期发生阻滞(表 2)。
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表 2 敲低lincRNA-p21对乏氧肿瘤细胞的细胞周期影响(%，±s)
Table 2 Effect of lincRNA-p21 knockdown on cell cycle arrest of hypoxic tumor cells(%, ±s) |
4. 敲低lincRNA-p21促进乏氧肿瘤细胞凋亡：用流式细胞术检测对数生长期细胞SMMC7721、U251MG乏氧(1%O2)培养48 h后，转染组和阴性对照组细胞凋亡情况。SMMC7721细胞阴性对照组和转染组细胞凋亡率为(1.27±0.05)%、(17.87±0.73)%；U251MG细胞阴性对照组和转染组细胞凋亡率为(1.96±0.59)%、(23.65±1.29)%，lincRNA-p21转染组凋亡率明显高于阴性对照组(t=42.27、24.79，P＜0.05)。表 明敲低lincRNA-p21能够促进乏氧肿瘤细胞凋亡。
5. 敲低lincRNA-p21提高乏氧肿瘤细胞放射敏感性：克隆形成实验检测对数生长期细胞SMMC7721、U251MG乏氧(1%O2)培养48 h，经0、2、4、6、8 Gy X射线照射后，转染组和阴性对照组细胞放射敏感性的变化，采用多靶单击模型拟合细胞存活曲线，见图 2。lincRNA-p21转染组和阴性对照组细胞之间存活分数差异明显。乏氧SMMC7721转染组和阴性对照组细胞平均致死剂量值为2.77和3.40 Gy，乏氧U251MG转染组和阴性对照组细胞D0值为3.07和4.02 Gy，结果表 明，敲低lincRNA-p21能够提高乏氧肿瘤细胞放射敏感性，放射增敏比为1.23和1.31。
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图 2 敲低lincRNA-p21对乏氧肿瘤细胞存活分数的影响 Figure 2 Effect of lincRNA-p21 knockdown on survival fraction of hypoxic tumor cells |
6. 敲低lincRNA-p21导致HIF-1α蛋白含量下降：乏氧(1%O2)培养细胞48 h，转染组HIF-1α 和GLUT1蛋白含量明显下降，表 明敲低lincRNA-p21能够降低乏氧肿瘤细胞HIF-1α和GLUT1蛋白含量(图 3)。
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注：1.转染组；2.阴性对照组 图 3 细胞乏氧培养48 h后HIF-1α和GLUT1蛋白含量变化 Figure 3 The expressions of HIF-1α and GLUT1 in the tumor cells after 48 h of hypoxia culture |
实体肿瘤由于组织增生过快常发生局部缺氧，HIF-1α在乏氧环境中表 达上调[4]，通过调控下游基因转录和蛋白表 达，影响肿瘤血管生成[5]，肿瘤细胞增殖[6]、凋亡和能量代谢[7, 8]，提高乏氧肿瘤细胞的辐射抗性[9]。lincRNA-p21参与多种人类疾病，特别是癌症的发生发展进程。本研究发现，lincRNA-p21是一种乏氧应答lincRNA，乏氧能提高lincRNA-p21表 达，且随着乏氧培养时间的延长而升高。同时建立稳定敲低lincRNA-p21的SMMC7721和U251MG细胞系，发现乏氧48 h后HIF-1α和GLUT1蛋白水平下降，表 明lincRNA-p21能够提高乏氧肿瘤细胞HIF-1α和GLUT1蛋白水平。肿瘤细胞表 现出氧化磷酸化减少和糖酵解增强的代谢特征，称为Warburg效应。Yang等[3]研究发现，lincRNA-p21通过调节HIF-1α通路对Warburg效应进行调控。常氧条件下HIF-1α脯氨酸羟基化后与 Von Hippel-Lindau(VHL) 结合，经泛素-蛋白酶体途径降解[10]。而乏氧条件下lincRNA-p21分别结合HIF-1α和VHL，干扰了VHL与HIF-1α之间的相互作用，减缓HIF-1α泛素化及随后的降解，从而稳定HIF-1α蛋白水平，HIF-1α反过来诱导lincRNA-p21表 达，从而形成一个正反馈环路。同时，证实了HIF-1α-lincRNA-p21环路会促进肿瘤形成。因此，lincRNA-p21可以作为一种药物靶点应用于癌症治疗中。
但是，在常氧条件下，Wang等[11]研究发现，过表 达lincRNA-p21通过抑制β-catenin信号通路和升高促凋亡基因Noxa的表 达来提高常氧结直肠癌(CRC)细胞的放射敏感性。根据lincRNA-p21的乏氧诱导特性，为探讨lincRNA-p21对乏氧肿瘤细胞放射敏感性的影响，本研究建立稳定敲低lincRNA-p21的SMMC7721和U251MG细胞系，发现在乏氧环境中敲低lincRNA-p21可提高乏氧肿瘤细胞放射敏感性，其机制可能与敲低lincRNA-p21诱导细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡，并导致HIF-1α蛋白水平下降有关。
Dimitrova等[12]发现，小鼠lincRNA-p21将核不均一的核糖核蛋白K(hnRNP-K)聚集到p21启动子，使p53与p21启动子有效结合来启动p21转录，激活p21表 达。并证实lincRNA-p21缺失可以降低p21的表 达并促进小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的增殖。然而，Huarte等[2]和Bao等[13]在MEF中敲低lincRNA-p21后没有发现p21表 达降低。故小鼠lincRNA-p21对p21的调控作用尚存争议。而人lincRNA-p21是否参与调控p21基因，以及人lincRNA-p21对乏氧肿瘤细胞放射敏感性调控的分子机制，需要进一步深入研究。
利益冲突 沈月明、杨巍所投稿的研究成果由国家自然科学基金面上项目(81071958，31570851)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)资助，之间没有可能影响研究结果的财务关系。且作者的配偶、工作伙伴和子女没有可能影响研究结果的财务关系。沈月明、杨巍没有可能影响研究结果的非财务冲突关系
作者贡献声明 沈月明负责进行试验、整理数据、论文撰写；杨巍负责提出研究思路、设计研究方案、分析数据和论文修改
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