随着核技术在军事、医学、科研等领域的广泛应用,核与辐射事故时有发生,医学上的放疗更是不可避免地造成不同程度的损伤,放射损伤的防治越发引起人们的重视。当前放射性损伤的治疗主要是应用细胞因子等抗辐射药物和造血干细胞移植,但各有其局限性。近年来,间充质干细胞(MSC)在免疫治疗和再生医学领域中的应用使得其在治疗放射性损伤方面得到了进一步研究。本文就间充质干细胞治疗急性放射损伤的研究进展进行综述。 一、急性放射损伤及其治疗现状

急性放射损伤是指机体受到一定剂量的某种射线照射后所产生的一系列生物效应,当损伤严重时可使组织器官发生不可逆的破坏甚至导致机体死亡。电离辐射可以通过能量传递直接作用,或是通过活化水分子产生自由基间接作用于生物分子,导致DNA损伤、细胞蛋白变性、生物膜脂质过氧化等,从而引起细胞损伤。在电离辐射的生物学效应中最重要的靶分子是DNA分子^[1],电离辐射通过直接或间接作用导致DNA损伤,如碱基受损、单链断裂和双链断裂等。其中双链断裂被认为是最严重的DNA损伤,它们可以导致染色质畸变,甚至不能完全修复。随着辐射剂量的增加,DNA损伤尤其是双链断裂发生率增加,细胞死亡的风险更高。

目前,治疗急性放射损伤主要有抗辐射药物与造血干细胞移植。抗辐射药物包括氨磷汀等化学类,500、523等激素类和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等细胞因子类。化学类、激素类等传统抗辐射药物治疗作用有限,且不良反应不易克服。细胞因子的应用对于重度骨髓型急性放射病作用显著,但由于极重度患者体内造血干细胞残存数量过少,不能恢复自身造血,细胞因子作用严重受限。造血干细胞移植常用于极重度骨髓型急性放射病的救治,对于极重度尤其是出现多器官损伤的患者,尽管可以重建造血功能,却仍死于移植物抗宿主病(GVHD)、感染或多脏器衰竭,至今数十例接受移植的患者无一长期存活。因此,寻找对急性放射性损伤更加有效的防治措施已成为当前的研究重点。 二、间充质干细胞在急性放射性损伤中的应用

MSC作为一种成体多能干细胞,能够自我更新、多向分化,来源广泛,且容易体外分离培养,具有组织损伤修复及免疫调节等作用,这些特性使得其在急性放射损伤的治疗中具有潜在的应用价值。目前,国内外关于MSC在放射损伤治疗中的研究已有大量文献报道^{[2, 3, 4]}。

近年来研究表明,作为造血微环境的主要细胞,MSC在维持造血干细胞的正常分化、促进移植后造血恢复方面发挥着重要作用。Hu等^[5]研究表明,对小鼠进行致死性剂量照射(8 Gy)时,一定剂量的MSC与骨髓间充质干细胞(BMC)细胞共移植可以明显改善小鼠生存;当对小鼠进行亚致死剂量照射(5 Gy)时,可以观察到,MSC可以减少小鼠骨髓细胞凋亡,加速受照射小鼠造血组织细胞的周期进程,骨髓造血岛和巨核细胞明显增加,三系(红细胞、粒细胞和血小板)造血恢复加快。对于亚致死剂量照射的小鼠,Shim等^[6]证明脐血MSC不仅对于白细胞、淋巴细胞、单核细胞等具有再生作用,并且在重建造血方面作用优于细胞因子G-CSF治疗。

然而,由于组织敏感性不同,电离辐射不仅会损伤造血系统,还会对其他敏感组织如肺、胃肠道、皮肤等造成不同程度的损伤。鉴于MSC组织修复作用,其在非造血组织放射性损伤中的应用也得到了进一步研究。

Kursova等^[7]研究表明,对于放射性肺损伤小鼠进行自体MSC输注,6个月内死亡率明显降低。相关临床试验表明,11例接受放疗导致放射性肺损伤的肿瘤患者,进行MSC输注联合标准治疗,经过1年的随访观察,未见引起潜在的肿瘤进展,同时多种检查如炎症检测、组织缺氧指数、外呼吸参数、免疫状况等均无不良变化,证明自体MSC治疗放射性肺损伤安全且有效。另外,Wang等^[8]也发现,预防性或治疗性应用hUC-MSC都能减轻小鼠放射性肺损伤,明显改善其生存状态。对于放射性肠损伤,Linard等^[9]通过给模型猪多次静脉输注自体骨髓来源的MSC后发现,全身炎症得到控制,直肠损伤部位的炎症及纤维化明显减轻。Sémont等^[10]不仅证明了MSC治疗有利于放射性肠损伤的修复,而且还发现了内源性MSC动员入血对于其持续修复损伤发挥重要作用。在小鼠放射性皮肤损伤模型中,Francois等^[11]证明,异基因移植hMSC能加速小鼠损伤的修复。Kotenko等^[12]发现,MSC治疗不仅能促进小鼠局部放射性皮肤损伤的愈合,而且对于临床上两例严重放射性皮肤损伤患者,自体MSC输注后肉芽组织快速生成,溃疡表面明显减小,最终完全上皮化。 三、间充质干细胞修复急性放射损伤的作用机制

尽管当前的研究大都支持MSC在急性放射性损伤中的修复作用,然而,其中所涉及的具体的修复机制仍然不确定。综合当前的研究结果,其中可能涉及以下几种主要机制。

1.归巢:组织损伤后,外源性MSC进入体内后能够选择性迁移并归巢至受损组织或炎症部位,从而参与损伤修复。其特异性归巢至靶组织是MSC修复辐射损伤的关键。Chapel等^[13]第1次证明在放射性损伤的灵长类动物中,MSC能归巢至肌肉、皮肤、骨髓及肠道等多种受损组织中。Francois等^[14]对NOD/SCID小鼠给予亚致死剂量的全身照射后静脉输入MSC,发现未照射组仅在肺、骨髓及肌肉等组织中有低水平植入,而全身照射组(TBI)脑、心脏、骨髓、肌肉等组织中MSC植入明显增加,另外,TBI联合腹部照射组可见腹部脏器如胃肠道、肝、脾等MSC植入增加,TBI联合腿部照射组可见局部受照部位皮肤、股四头肌MSC植入增加。由此,进一步证明了MSC向受损组织迁移归巢的特性。Sémont等^[10]证实外源性MSC能归巢至辐射损伤的肠黏膜下及肠系膜内,但两周后却检测不到外源性的GFP阳性MSC,而血中内源性的MSC增加,表明MSC输注不仅能植入至损伤部位,还能动员内源性的MSC入血,从而进一步增强辐射损伤的修复。

然而,MSC具体的细胞归巢机制仍不清楚。目前认为,在机体损伤或炎症时,局部微环境发生变化,许多信号分子表达上调,介导MSC从循环中的靶向迁移。研究表明,许多生长因子(PDGF、IGF-1等)、趋化因子(CCR2、CCR3、CCR4、CCL)、黏附分子以及基质金属蛋白酶等均在MSC的靶向迁移中发挥重要作用^[15]。其中趋化因子SDF-1及其受体CXCR4在MSC的细胞迁移中发挥了重要作用。辐射损伤的组织细胞或炎症细胞分泌SDF-1,使得机体受损或炎症部位SDF-1水平上调,趋化表达CRCX4的MSC迁移归巢至损伤部位,从而参与组织修复。Francois等^[16]在放射性肝损伤模型中证实,受损肝组织中SDF-1表达增加,MSC输入后迅速大量表达其配体CXCR4,另外mir-27b在受损肝组织中低水平表达,通过上调SDF-1水平也参与MSC的迁移。

2.分化:自从20世纪90年代,MSC的分化潜能得到大量研究。它起源于中胚层,具有多向分化潜能。研究表明,在特定的诱导培养条件下,MSC不仅可以向骨、软骨和脂肪细胞等中胚层细胞分化,还可以跨胚层分化为外胚层的神经元细胞和内胚层的肝细胞等。Sasaki等^[17]在皮肤受损处检测到输入的GFP阳性MSC部分表达有角质形成细胞、内皮细胞及周围细胞的标记物泛细胞角蛋白、CD31和α-SMA,表明MSC在局部皮肤损伤修复过程中发生了向多种皮肤细胞类型的转分化。Francois等^[16]在放射性肝损伤模型中证实,植入的MSC可以表达肝细胞的特定表达产物CK18、CK19和AFP,表明MSC向肝细胞转分化参与了受损肝组织的修复过程。然而,这部分分化的细胞只占肝细胞整体的一小部分,不到2.5%,不足以逆转辐射所致的损伤。Sémont等^[18]通过定量PCR发现,放射性肠损伤小鼠的肠上皮内hMSC植入水平非常低,仅占(0.13±0.06)‰。由于MSC在损伤部位的低水平植入以及其相对较短的生存期限,单纯的组织分化并不能完全解释MSC的修复作用,可能只是其修复损伤的部分机制。

3.免疫调节:MSC具有低免疫原性,它低水平表达MHC I类抗原,不表达MHC II类抗原,也不表达共刺激分子CD40、CD80和CD86。这些特征使得MSC可以逃避宿主的免疫监视系统,免受同种反应性自然杀伤细胞(NK)细胞裂解杀伤。目前,接受异基因hMSC治疗的患者并未表现出T细胞激活,也未产生任何抗异基因MSC的抗体,因此,在进行异体移植时不会发生排斥反应,从而保证了其效应的发挥。此外,MSC还能通过直接的细胞接触或者分泌一些免疫调节分子如NO、IDO、PGE2、IL-6、IL-10等,抑制T、B细胞的增殖活化、抑制DC细胞的成熟、抑制NK细胞的增殖和活性,促进Treg细胞的生成和功能^[15]。

MSC免疫抑制最重要的结果主要表现在造血干细胞移植(HSCT)后aGVHD的防治上。目前,关于MSC用于治疗GVHD已有许多临床试验,其中一部分已进入Ⅲ期临床或Ⅱ/Ⅲ期联合试验^[19]。2008年山西太原事故中放射性损伤患者接受HSCT后输注供者来源的MSC,显示出良好的抗GVHD效果^[20]。Qiao等^[21]对经过致死性全身照射的小鼠输入骨源性的MSC后,Treg细胞扩增;T细胞细胞因子受体表达改变,CCR5和CXCR3表达下调,CCR7表达上调,从而减少活化T细胞向炎症部位的迁移,减轻免疫损伤;Th1细胞免疫功能下降,IFN-γ等炎性因子生成减少,使Th1/Th2平衡向抗炎性的Th2细胞极化倾斜。表明MSC的免疫保护机制对于受照小鼠加快造血恢复,改善生存也发挥了重要作用。

4.营养作用:MSC能分泌许多造血生长因子如G-CSF、SCF、TPO等支持造血,还能分泌其他营养分子,包括非造血生长因子(HGF、KGF、VEGF、TGF)、白介素、黏附素、趋化因子以及细胞外基质糖蛋白等。这些营养分子可以促进细胞间相互作用,不仅能减轻受损组织处的炎症、凋亡和纤维化过程,还有利于组织细胞的再生。近年来,越来越多的证据表明MSC的治疗作用主要是基于其旁分泌的各种营养分子。

张晓玲等^[22]对小鼠进行6 Gy全身照射后输注MSC,2 d后治疗组小鼠血清中检测到G-CSF、SCF等造血生长因子,并且与对照组相比,其血清G-CSF水平明显增加,表明MSC可能是通过分泌造血生长因子促进造血恢复的。Francois等^[16]证明,静脉输注的外源性MSC能优先迁移到肝组织的血管周围区域,通过增加VEGF和Ang-1的表达,维持内皮功能,促进血管生成,能分泌HGF、NGF等生长因子及一些抗炎因子如IL-10、IL-1RA等有助于减少细胞凋亡,促进细胞增殖,另外,MSC治疗还能促进受损肝组织中Nrf2、SOD的表达增加,从而在清除活性氧,减轻辐射所致的氧化应激方面也发挥了一定作用。Xue等^[23]研究发现,只有0.1%的肺细胞属于供者的MSC来源,一方面,如此低比例的分化并不能充分解释所观察到的肺损伤保护作用,另一方面,MSC的培养上清液在体内能减轻放射性肺损伤,体外能调节炎性反应,保护Ⅱ型肺泡上皮细胞对抗放射性损伤。这表明MSC的辐射保护作用更多的是由于其旁分泌机制。 四、基因修饰的间充质干细胞在急性放射性损伤中的应用 MSC易于外源基因的转染和表达,且免疫原性低,具有可植入性,因此可以作为基因治疗的细胞载体,被认为是一种理想的组织工程种子细胞。通过基因工程将外源性基因导入到MSC内,使其具有过表达或者沉默表达某种基因的能力,协同发挥基因治疗与细胞治疗的优势,进一步增强其抗辐射损伤的作用。

Xue等^[23]通过TGF-βⅡ型受体修饰的MSC,在肺组织中过表达可溶性TGF-βⅡ型受体,竞争性结合TGF-β1,阻断下游的信号转导通路,从而减少胶原沉积和肺纤维化,减轻放射性肺损伤,改善小鼠的生存。Wang等^[24]发现肝细胞生长因子修饰后的MSC也可以通过调节局部细胞因子的表达水平减轻肺部炎症,抑制肺部纤维化,从而修复放射性肺损伤。

由于特异性趋化至靶组织在MSC修复损伤过程中发挥重要作用,在放射性损伤的小鼠模型中,Yang^[25]和臧宇等^[26]利用修饰的MSC过表达趋化因子SDF-1的受体CXCR-4,通过提高其向受损部位的定植能力,分别证明了该种方法修饰的MSC能加速修复皮肤损伤,促进造血恢复。辐射会引起活性氧类物质堆积,使机体组织处于氧化应激状态。通过基因修饰使得MSC过表达某种抗氧化物质,可以改善组织的氧化应激状态,从而修复放射性损伤。Abdel-Mageed等^[27]将腺病毒介导的超氧化物歧化酶(ECSOD)修饰的MSC输注给接受9 Gy全身照射的小鼠,相对于单纯的MSC组,修饰后的MSC能明显改善受照小鼠的生存率(9% vs. 52%)。Hu等^[28]用另一种氧化还原蛋白hTRX修饰的MSC也能减轻小鼠放射性损伤,延长小鼠生存时间。并且其在保护和促进造血恢复,减轻肺损伤,改善小鼠生存时限等方面优于普通的MSC组。

另外,Hao等^[29]利用基因修饰后的MSC治疗放射性复合伤,通过其过表达具有抗菌作用的人β防御素和促有丝分裂的人血小板源性生长因子,促进胶原沉积和肉芽形成,抑制细菌增殖,从而更加有效地加速伤口愈合,修复损伤。Xia等^[30]发现,hVEGF165/hBD3修饰的MSC同时过表达血管内皮生长因子和β防御素,也能促进小鼠放射性复合伤的修复。 五、问题与展望 尽管MSC在急性放射性损伤中的应用已得到大量研究,然而大部分只涉及动物试验,距离实际的临床应用仍有很大差距。而且,当前还有很多问题仍不清楚:MSC修复放射性损伤的作用机制,MSC的应用时机、最优细胞数、输注次数及应用途径,不同来源的MSC对急性放射性损伤的疗效差别。另外,基因修饰后MSC的安全性以及其对MSC治疗作用的影响也有待进一步验证。相信在不久的将来,随着研究的进一步深入,MSC在治疗急性放射性损伤方面应用前景更加广阔。