氡(²²²Rn)是继吸烟之后导致肺癌的第二大危险因素。氡吸入体内后,其衰变产生的α粒子可在人的呼吸系统沉积,造成辐射损伤,引发肺癌。居民长期生活在高氡温泉周围的环境中,受到氡及其子体的持续性和累积性作用。miRNAs是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA,通过与靶mRNA碱基配对参与基因转录后调控活动。目前,大多数研究已证实miRNAs在电离辐射引起的细胞反应中起着重要的调节作用。本研究在前期研究的基础上,探讨氡温泉对周围居民外周血血浆中miR-16、miR-106b、miR-34a、miR-449a和let-7g表达的影响。

1.研究对象:河北省平山县居民,纳入标准为无急、恶性疾病,无嗜烟酒等。氡温泉组为采用简单随机方法抽取的该地氡温泉周边居民,共41人。赵孟奇等^[1]检测结果显示,该地温泉水中氡的浓度为(102±11.4)Bq/L,室内氡浓度6个月均值为(41.9±18.6)Bq /m³。同时,随机抽取与其距离约11.2 km生活习惯相似但未长期接触过氡温泉的其他村居民作为健康对照组,共46人。全部研究对象均签署知情同意书。氡温泉组和健康对照组两组居民的年龄、性别、吸烟和饮酒情况差异均无统计学意义,具有可比性,见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 研究对象基本资料分析结果

表 1 研究对象基本资料分析结果

2.血浆miRNAs提取:乙二胺四乙酸二钾(EDTA-k2)抗凝真空采血管收集静脉血,用TRIzol LS试剂和miRNeasy试剂盒(德国Qiagen公司)提取所有样品血浆miRNAs(液相分离前加入25 fmol的cel-miRNA-39做外源性内参),-80 ℃冻存备用。

3.cDNA的合成:用TaqMan miRNA反转录试剂盒(美国ABI公司),以总miRNAs各2.0 μl为模板合成cDNA,反应体系包括:100 mmol/L dNTP,0.1 μl;反转录酶,0.5 μl;10×反转录缓冲液,0.75 μl;RNA酶抑制剂,0.1 μl; miRNA反转录引物,0.5 μl;miRNA,2.0 μl。反应条件:16℃ 30 min,42℃ 30 min,85℃ 5 min。

4.引物设计和合成:miRNA引物及探针由美国ABI公司TaqMan miRNA assays试剂盒提供,探针序列分别为:cel-miR-39: 5' UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG 3'; hsa-miR-16:5' UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 3'; hsa-miR-106b:5' UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU 3'; hsa-miR-449:5' UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU 3'; hsa-let-7g:5' UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 3'; hsa-miR-34a:5' UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 3'。

5.实时荧光定量PCR:应用TaqMan PCR system (美国ABI公司)在7500快速实时荧光PCR仪(美国ABI公司)检测miR-16、let-7g、miR-106b、miR-449a和miR-34a的表达水平。Real-time PCR反应:95℃,10 min预变性;95℃,15 s变性;60℃,1 min 退火延伸,50个循环进行扩增。通过循环阈值(Ct值)来量化miRNAs的相对表达水平,由于Ct值>40时可能会出现非特异性扩增,因此Ct值>40则舍弃。本研究选择cel-miR-39作为qRT-PCR实验的内参来标化实验数据。每个样品重复3次,用2^-ΔCt公式来计算经内参cel-miR-39标化后的相对表达量,ΔCt=靶miRNA的平均Ct值－内参的平均Ct值。

6.统计学处理:采用SPSS 16.0软件,对基本资料进行t检验和χ²检验,用Mann-Whitney U检验比较miRNAs在氡温泉组和健康对照组血浆中的差异表达,选择氡暴露、年龄、性别、吸烟和饮酒等变量,采用强迫引入法拟合多重线性回归,分析miRNAs的差异性表达和居民氡暴露因素的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

1. miRNAs在氡温泉组和健康对照组血浆中的差异表达:miR-16、miR-106b、miR-34a、miR-449a和let-7g在氡温泉组血浆中的表达水平显著上调(Z=-2.278、-3.835、-2.084、-2.719、-2.721,P<0.05),见表 2,以上各miRNAs两组Fc_中位数(表示倍数变化)分别为1.23、1.65、1.43、1.91和1.82。

表 2(Table 2)

表 2 miRNAs(2-△Ct)在41例氡温泉组和46例健康

表 2 miRNAs(2-△Ct)在41例氡温泉组和46例健康

2. miRNAs表达与各因素的回归分析:选择氡暴露、年龄、性别、吸烟和饮酒等变量,采用强迫引入法拟合多重线性回归。结果显示,miR-16、miR-106b、miR-449a和let-7g(t=2.154、3.711、2.319、2.015,P<0.05)的差异性表达和居民氡暴露因素呈正相关,而不能认为与年龄、性别、吸烟和饮酒等因素有显著性相关(P>0.05)。但是对于miR-34a(t=1.772,P=0.08)的表达改变还不能认为与氡暴露有关,同样与年龄、性别、吸烟和饮酒等因素也没有显著性相关(P>0.05),见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 所有受检者外周血血浆中miRNAs表达水平相关因素 的多重线性回归

表 3 所有受检者外周血血浆中miRNAs表达水平相关因素 的多重线性回归

早有研究证实电离辐射能够诱发肿瘤,并且高LET辐射(如α粒子)比X射线和γ射线具有更强的辐射损伤效应^{[2, 3]}。氡温泉对周围居民的辐射损伤主要是通过氡及其子体在其衰变过程中产生α粒子引起的,因此了解其生物学作用非常重要。目前的研究主要集中在α粒子辐射对细胞系miRNAs表达改变的影响,而α粒子辐射对人外周血血浆中miRNAs表达改变的研究则很少。本研究的重点是分析α粒子辐射对人外周血血浆中miRNAs表达的影响。

本研究中,由于氡温泉组和健康对照组资料为正偏态分布,且转换后的资料分布也不理想,所以采用秩和检验。研究发现血浆中miR-16、miR-106b、miR-34a、miR-449a和let-7g在氡温泉组的表达水平均显著增加,分别是健康对照组的1.23、1.65、1.43、1.91和1.82倍。将氡暴露、年龄、性别、吸烟和饮酒等因素引入多重线性回归分析时,miR-16、miR-106b、miR-449a和let-7g的表达改变与氡暴露因素有关,而与年龄、性别、吸烟和饮酒等因素无关。但是对于miR-34a,还不能认为其表达改变与氡暴露相关。

[JP+2] 在Wagner-Ecker等^[4]关于人内皮细胞的研究中发现,2 Gy X射线作用后let-7g和miR-16均有不同程度的表达上调。同样,Chaudhry等^[5]研究发现,miR-16、miR-106b和let-7g不但表达上调,而且发现这些miRNAs表达的改变可能呈时间依赖性。此外,也有研究发现在电离辐射作用后miRNAs的表达改变与照射剂量和细胞类型有关^{[6, 7]}。目前大部分研究的miRNAs表达改变大多是在较大剂量的低LET辐射作用下发生的。而在高LET辐射作用下,Chauhan等^[8]研究发现3种细胞系(人肺腺癌细胞A549、人单核细胞白血病细胞THP-1和人肺成纤维细胞HFL)在0.5、1和1.5 Gy的α粒子辐射作用下miRNAs表达各不相同且互不重叠,同样的细胞系不同剂量下miRNAs表达改变也有不同。这表明α粒子辐射作用于不同细胞类型或不同剂量所引起的基因调控网络也不同。综上所述,辐射可以诱导基因调控网络的生物学效应,而这些生物学效应随着细胞类型、辐射类型、剂量和受照时间的不同而改变。miR-449a与肿瘤抑制因子miR-34家族具有相同的种子序列,具有促进细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡的作用^{[9, 10, 11]}。目前,关于miR-449a与电离辐射的研究报道很少。本研究发现miR-16、miR-106b、miR-449a和let-7g 4个miRNAs表达均上调,研究结果虽然与上述大部分研究结果一致^{[4, 5, 6, 7]},但是温泉氡属于低剂量高LET辐射,Chauhan等^[8]认为高LET辐射可能激活与低LET辐射不同的生物效应途径,甚至Cha等^[12]认为低剂量辐射可能通过控制miRNA的表达抑制恶性肿瘤的进展。故本研究中miRNAs表达上调的具体机制还有待于进一步研究。对于在相同的辐射类型α粒子作用下,本研究结果与Chauhan等^[8]研究发现的miR-16下调结果不同,其原因可能是由于照射剂量不同所致。

在上述差异表达的4个miRNAs中,除miR-449a和let-7g上调接近2倍外,其余miRNAs表达上调幅度不大,可能是由于本研究中的倍数变化采用中位数之比计算所得,因为中位数不是利用全部观察值计算出来的,它只与位次集中的观察值大小有关,不能反映全部观察值的平均水平。所以在计算中位数倍数变化时,可能损失了部分信息。

此外,研究发现miR-34a在氡温泉组的表达水平高于健康对照组(P=0.08)。秦宏冉等^[13]对四川省降扎异常高氡温泉对周围居民外周血中miRNA的表达分析中发现,高氡组miR-34a和miR-34b表达明显上调,分别是健康对照组的15.7倍和351.24倍。至于本研究未检测到差异有统计学意义,可能是因为样本量较小,或者是因为所研究地区氡水平低于四川省降扎地区,需要增加样本量进行深入探讨。

综上所述,miR-16、miR-106b、miR-449a和let-7g 在氡温泉组居民血浆中的表达水平显著上调,可能具有作为氡致辐射损伤的早期标志物的潜在价值。但是其表达显著上调的具体机制还有待于进一步研究。