放射性肺纤维化是胸部恶性肿瘤放疗后常见的并发症，严重者对肺功能和生活质量乃至生命带来极大的危害。转化生长因子β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)是肺纤维化疾病发生发展过程的重要因子^{[1, 2]}。本研究通过对比检测受照前后人胚肺成纤维细胞（HFL-1）的基因谱，寻找相同基因的差异改变，并观察验证TGF-β1的差异特征，以基因沉默法干预其表达及Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen typeⅠ/Ⅲ,COLⅠ/Ⅲ) 产生，在细胞水平观察TGF-β1 siRNA干预纤维化的作用，为临床放射性肺纤维化的治疗提供新方法及理论依据。

1.细胞培养：HFL-1细胞系购自上海中科院细胞库(目录号GNHu28），采用F12k培养基，10%胎牛血清（FBS），100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，37℃、5% CO₂饱和湿度下培养，挑选对数生长期细胞进行实验。

2.细胞分组：将HFL-1细胞分为单纯照射组和空白对照组行基因芯片实验，观察HFL-1细胞受照前后的基因差异表达；选择致纤维化基因TGF-β1，设计siRNA，将HFL-1细胞分为单纯照射组、阴性对照siRNA及TGF-β1 siRNA组，观察TGF-β1 siRNA对TGF-β1的沉默作用；将HFL-1细胞分为单纯照射组、TGF-β1 siRNA组、地塞米松组,及TGF-β1 siRNA联合地塞米松组，对比不同干预手段对HFL-1细胞受照后胶原生成的影响。

3. siRNA设计和转染：4条TGF-β1 siRNA及1条随机选取无干扰效果阴性对照序列(表1)。将上述4条TGF-β1 siRNA按照同比例混匀于同一体系中，构成siRNA pool，利用Lipofectamine2000进行转染。溶于DMSO的地塞米松溶液浓度为0.2 μmol/L。siRNA转染实验在细胞照射前24 h进行，以获得最佳的干扰效果。

表1()

表1 TGF-β1 siRNA和阴性对照siRNA的序列

表1 TGF-β1 siRNA和阴性对照siRNA的序列

4. 细胞损伤模型构建：将接种于6孔板的细胞在美国瓦里安Trilogy直线加速器下照射。6 MV X射线，照射剂量500 cGy/次，剂量率为400 cGy/min，照射野面积10 cm×10 cm，照射距离100 cm，表面覆盖1.5 cm厚聚苯乙烯。分别于照射后的24、48和72 h收集细胞及培养液上清保存于-80℃。

5.基因芯片分析：芯片实验由上海伯豪生物有限公司完成。实验RNA采用Affymetrix表达谱芯片配套试剂盒，GeneChip 3′IVT Express Kit(Cat#901229,美国Affymetrix公司)和标准操作流程，在照射24 h对空白对照组和单纯照射组细胞总RNA中的mRNA进行放大、标记和纯化，获得带有生物素(biotin)标记的cRNA后进行芯片杂交。

6.FQ-RT-PCR检测TGF-β1、COLⅠ、COL Ⅲ和α-SMA mRNA：引物设计根据GeneBank中查找出的目的基因及内参基因的mRNA序列，用Primer5.0软件设计，上下游引物由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。

表2()

表2 荧光定量RT-PCR基因引物序列

表2 荧光定量RT-PCR基因引物序列

7．ELISA检测TGF-β1蛋白：配制标准品，加样，孵育抗体，显色，加终止液。在30 min内用酶联仪在450 nm波长依次测量各孔的吸光度（A）值。绘制标准曲线，计算样品中蛋白的浓度。

8. 免疫组织化学检测COLⅠ和Ⅲ：细胞爬片，固定，孵育抗体，显色，封片。COLⅠ和COL Ⅲ表达主要位于细胞质，结果判定采用双盲法由两位专家进行，在光镜下进行半定量结果判断。染色强度分数标准按参考文献^[3]进行。

9. Western blot检测COLⅠ和Ⅲ蛋白：细胞蛋白抽提后，按BCA法测定蛋白浓度，然后通过SDS-PAGE电泳分离，硝酸纤维膜转膜后封闭2 h，分别加入COLⅠ和Ⅲ及GAPDH抗体孵育，加入二抗孵育1 h后，化学发光法显示蛋白条带，胶片显影、定影。

10. 消化法测定羟脯氨酸(HYP)：按照南京建成生物有限公司的HYP测试盒说明书进行。

11. 统计学处理：所有实验重复3次，测得数据以±s表示，采用Stata 7.0统计软件分析数据。样本均数两两比较，采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1.基因表达分析： 24 h单纯照射组HFL-1细胞中>2倍的上调基因有771个，下调基因有1 108个；>3倍的上调基因有350个，下调基因有558个；>5倍的上调基因有213个，下调基因有348个，TGF-β1上调5.154倍。这些差异表达的基因主要涉及信号转导、能量代谢、分子黏附、酶活性和转录翻译调节方面。与纤维化有关基因差异倍数为2.259～12.349，TGF/Smad基因为主要参与者。

2. HFL-1细胞受照后TGF-β1和HYP的表达：检测受照后TGF-β1 mRNA表达,单纯照射组受照后24和48 h 较空白对照组明显升高(t=-18.580、-13.900,P<0.05)。ELISA法显示，照射后48和72 h的TGF-β1蛋白表达与RT-PCR结果一致(t=-12.445、-28.097,P<0.05)。HYP消化法显示，照射后48和72 h单纯照射组HYP水平较空白对照组显著升高(t=-3.987、-7.003，P<0.05，表3)，提示HFL-1受照后TGF-β1及HYP均显著升高。

表3()

表3 两组细胞照射后不同时间TGF-β1 mRNA、TGF-β1和HYP的表达(±s)

表3 两组细胞照射后不同时间TGF-β1 mRNA、TGF-β1和HYP的表达(±s)

3. TGF-β1 siRNA转染效率：荧光显微镜下转染TGF-β1 siRNA的HFL-1细胞胞质呈绿色荧光，未转染的细胞则无，转染效率可达95%。

4.TGF-β1 siRNA的干预作用：TGF-β1 siRNA组TGF-β1 mRNA水平较单纯照射组，在照射后24和48 h分别下调67.196％(t=13.235,P<0.05)和74.836％(t=10.978,P<0.05)。TGF-β1蛋白在放射后48和72 h分别下调72.559％(t=9.728,P<0.05)和76.486％(t=22.269,P<0.05,表4)。

表4()

表4 3组细胞处理后不同时间TGF-β1 mRNA及TGF-β1表达(±s)

表4 3组细胞处理后不同时间TGF-β1 mRNA及TGF-β1表达(±s)

5.不同方法干预TGF-β1对胶原作用的比较：与单纯照射组比较，TGF-β1 siRNA、地塞米松、TGF-β1 siRNA联合地塞米松组均能有效降低TGF-β1(t=13.235、6.943、-17.431,P<0.05)、α-SMA(t=12.548、6.966、13.988,P<0.05)、COLⅠ(t=12.433、8.164、16.315,P<0.05)和COL Ⅲ (t=5.919、3.164、9.420,P<0.05) mRNA；且TGF-β1 siRNA作用优于地塞米松(t=7.110、7.976、4.196、5.935,P<0.05)，见图1。

图1()

注：a与单纯照射组比较，t=-17.431～16.315,P<0.05； b与地塞米松组比较，t=7.110、7.976、4.196和5.935，P<0.05 图1 各处理组TGF-β1、α-SMA、COLⅠ、COLⅢ mRNA表达分析

免疫组织化学染色显示，COLⅠ和Ⅲ主要表达在胞质，呈淡黄色或棕褐色，胞核呈蓝色。TGF-β1 siRNA组COLⅠ和Ⅲ较单纯照射组棕褐色范围小、着色程度浅，差异有统计学意义(t=4.242、3.536,P<0.05,图2)，且上述3种方法干预胶原产生的强弱趋势与基因结果一致。Western blot结果亦如此（图3）。

图2()

注：1.单纯照射组；2.阴性对照siRNA组；3.地塞米松组；4.TGF-β1组；5.TGF-β1联合地塞米松组 图2 各处理组COLⅠ和Ⅲ蛋白表达镜下观察 免疫组织化学染色 ×200

图3()

注：1.单纯照射组；2.阴性对照siRNA组；3.地塞米松组； 4.TGF-β1组；5.TGF-β1联合地塞米松组 图3 各处理组COLⅠ和Ⅲ蛋白表达分析

放射性肺损伤、肺纤维化限制放射治疗的剂量，阻碍肿瘤的控制，影响患者的生活质量，甚至导致肺功能不全及死亡^[4]。放射性肺纤维化的防治，糖皮质激素已被广泛使用，多年来被认为是标准治疗方法，但有很多不良反应，如高血压、高血糖、骨质疏松、免疫抑制致肿瘤复发^[5]。新的药物，如吡非尼酮和细胞抗氧化剂已在动物实验和临床试验中研究应用，然而其疗效不确切，也缺乏大量随机对照临床试验的依据^{[6, 7, 8]}。因此，迄今为止，放射性肺纤维化尚缺乏有效的治疗手段，亟待寻找新的安全有效方法。

在一系列的生长因子和细胞因子中，TGF-β1是各种生物过程中的多效性细胞因子。已有研究表明，TGF-β1与纤维化疾病的发生发展密切相关^{[9, 10]}。本研究首先通过基因芯片技术分析HFL-1细胞受照后的相同基因差异表达。结果显示，HFL-1细胞受照后差异基因总数为1 879个，上调基因为771个,下调基因为1 108个，其中上调5倍以上的基因213个，这些差异表达的基因主要涉及信号转导、能量代谢、分子黏附、酶活性和转录翻译调节方面功能。与纤维化有关基因差异倍数为2.259～12.349，TGF-β1上调5倍多，TGF/Smad基因是纤维化的主要参与者。

根据前期的研究^[11]及本实验基因谱结果，选择TGF-β1基因作为纤维化发生的关键基因。以RT-PCR和ELISA法检测了受照后TGF-β1的表达。发现500 cGy 6 MV X射线单次照射细胞，明显上调TGF-β1表达，符合基因芯片结果。研究中选取HYP、COLⅠ和Ⅲ作为TGF-β1 下游产物纤维化指标反映纤维化程度，发现照射组细胞HYP水平显著升高，与TGF-β1的表达平行，提示TGF-β1的上调导致纤维化产物增加，与其他研究者报道一致^[8]。因此，鉴于TGF-β1是放射性肺纤维化发展过程的关键因子，干预TGF-β1上调应当成为阻止纤维化产物的治疗靶点。

RNAi，又称转录后基因沉默，指将特异性同源小双链RNA (dsRNA)分子导入细胞，降解与其序列互补配对的mRNA，诱导特异的目标基因沉默^[12]。RNAi广泛用于治疗病毒性感染、肿瘤、免疫缺陷病和遗传疾病，特别是癌症、艾滋病和肝脏疾病^[12]。本研究中，TGF-β1 siRNA由4个外源合成的双链siRNA制备的siRNA pool构成，转染细胞后首先观察转染效率，发现siRNA转染效率可高达95%。RT-PCR和ELISA结果表明TGF-β1 siRNA明显下调TGF-β1的表达，说明RNAi可有效地沉默TGF-β1基因。实验进一步发现，TGF-β1表达抑制后，α-SMA、COLⅠ和Ⅲ的合成明显减少。

地塞米松是一种肾上腺皮质激素，为临床常用的抗放射损伤药物，主要通过非特异抗炎和抗过敏作用，抑制炎症介质和细胞因子产生，从而阻断TGF-β1和纤维化物质的产生。有文献表明，地塞米松可有效地改善肺功能^[5]。其抗炎作用确切，但不良反应大。本研究对比观察地塞米松和TGF-β1 siRNA的抗胶原作用，结果表明，TGF-β1 siRNA作用优于地塞米松，且两者联合应用具有协同作用。

综上所述，本研究首次采用基因芯片技术，分析HFL-1细胞受照前后相同基因差异表达，其中TGF-β1明显上调，而TGF-β1 siRNA可成功干扰其合成，下调纤维化产物胶原的产生，且作用优于地塞米松，推测是因其能沉默与之序列互补配对的目标基因，特异性高所致。

本研究中，TGF-β1 siRNA仅在体外得到可喜的结果，有待进一步进行体内实验。基因芯片结果中上调更高倍数的基因亦有待进一步探讨。