随着电离辐射的广泛应用,中、低剂量的电离辐射损伤受到关注,如可引起头晕、乏力、食欲下降、免疫力降低、白细胞降低、造血系统损伤、染色体畸变等症状^[1]。因此,对电离辐射损伤防护药物的研发亦日益增多。四君子汤,始记于《太平惠民和剂局方》,由人参、白术、茯苓、甘草组成,具有益气健脾之功,临床常用于面色萎黄、语声低微、气短乏力、食少便溏、舌淡苔白的患者^[2]。药理学研究表明,四君子汤具有提高免疫系统活性的能力^[3];临床研究发现,四君子汤可通过调节细胞因子的水平增强免疫功能的作用^[4]。因此,推测四君子汤适用于中、低剂量电离辐射损伤患者。本研究主要观察四君子汤对小鼠免疫器官脾脏脏器系数及脾细胞凋亡的影响;同时,考察四君子汤对骨髓嗜多染红细胞微核率的改变,以探讨四君子汤对电离辐射所致免疫力降低和造血功能下降的防治作用。

1. 仪器与主要试剂:BH-2型显微镜,购自日本Olympus公司;FACSCalibur型流式细胞仪,购自美国BD公司;Multiskan GO型酶标仪,购自美国Thermo公司; 5810 R型离心机,购自德国Eppendorf 公司;TP-214型分析天平,购自北京丹佛仪器有限公司;Milli-Q A10型纯水仪,购自美国Millipore公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,购自南京凯基生物有限公司。

2. 药物制备:人参、白术、茯苓、甘草等生药饮片,购自北京德威治大药房。将四君子汤生药饮片置于回流加热装置中,第1次加入约10倍量蒸馏水,浸泡0.5 h,武火煮沸后,文火(保持微沸状态)煎2 h;60目筛网滤过,药材再加约10倍量蒸馏水,武火煮沸后,文火煎1 h。合并2次水煎液,水浴浓缩后60℃真空干燥为粉末,得率42％,即1 g原生药等价于0.42 g提取物。

3. 照射条件:北京师范大学化学学院钴源⁶⁰Co γ射线照射,小鼠单次全身照射的吸收剂量为3.5 Gy,剂量率均为1.0 Gy/min,源靶距1.15 m。

4. 实验动物分组及给药方案:BALB/c小鼠80只,SPF级,雌雄各半,6~8周,18~22 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物使用许可证号SCXK(京)2006-0025;于中国疾病预防控制中心职业卫生所饲养,动物实验设施使用许可证号SYXK(京)2009-0032,饲养条件为光照12 h,饲养温度23~26℃,湿度40%。适应性喂养3 d 后,将小鼠按体重大小编号,按随机数字表法进行完全随机化分组,设阴性对照组、照射对照组、四君子汤高、中、低剂量组,每组16只。按人用剂量推算小鼠给药剂量为2.25 g/kg(按原方生药量计算),设为四君子汤中剂量组给药剂量;由此,设定低剂量组给药剂量为0.75 g/kg,高剂量组给药剂量为6.75 g/kg。给药方案为照前7 d和照后7 d给药,每天灌胃给药1次,0.5 ml/只。阴性对照组和照射对照组给予等体积的纯水。

5. 受照小鼠脾脏系数检测:小鼠接受全身一次性3.5 Gy γ射线照射,照射后3和7 d,小鼠称重后,脱颈处死,取脾脏,称重,计算脏器系数。脏器系数＝脏器质量(mg)/体质量(g)。

6. 受照小鼠脾细胞凋亡检测:脾脏称量后,立刻用PBS液冲洗,用磨砂玻璃棒在细胞过滤筛上轻轻研磨去除表面结缔组织,收集细胞悬液,用PBS洗2次,以离心半径17.8 cm,2 000 r/min离心5 min,弃上清液。上机前以红细胞裂解液处理,PBS洗涤细胞2次,以离心半径17.8 cm,2 000 r/min离心5 min,然后制成约1×10⁵/ml细胞悬液,按照试剂盒说明书操作。流式细胞仪测定各组脾细胞凋亡率。

7. 受照小鼠骨髓嗜多染红细胞微核计数:小鼠脱颈椎处死,取胸骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片。涂片自然干燥后放入甲醇中固定5~10 min。将固定好的涂片放入Giemsa染色10~15 min。立即用纯水冲洗,晾干,镜检。选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。记录约1 000个嗜多染红细胞,计算微核率。

8. 统计学处理:所有计量资料均以 ± s表示,组间比较用独立样本t检验,采用SPSS 16.0软件进行分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

1. 四君子汤对受照小鼠脾脏系数的影响:3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后,小鼠脾脏严重受损,与阴性对照组比较,小鼠的脾脏系数显著降低(t=10.278、24.281,P < 0.05)。受照后3~7 d,小鼠的脾脏系数均持续降低;受照后7 d,与照射对照组相比,四君子汤各剂量组小鼠的脾脏系数均有不同程度的升高,其中中剂量组小鼠的脾脏系数升高最为显著(t=-3.686,P < 0.05)。提示四君子汤各剂量组可有效抑制脾脏细胞的辐射损伤,促进脾脏细胞增殖,增加脾脏重量(表1)。

表 1()

表 1 四君子汤对3.5 Gy受照小鼠脾脏系数和嗜多染红细胞微核率的影响( ± s)

表 1 四君子汤对3.5 Gy受照小鼠脾脏系数和嗜多染红细胞微核率的影响( ± s)

2. 四君子汤对受照小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响:受3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后3和7 d检测,照射对照组小鼠骨髓嗜多染红细胞中微核数量显著增加,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(t=-4.196、-4.122,P < 0.05)。与照射对照组相比,照后3和7 d,四君子汤各剂量组均可以降低受照小鼠骨髓嗜多染红细胞中的微核数量(t=6.020、2.708、4.976、2.914、3.285、8.000,P < 0.05)。照后3 d虽微核率减少,但未见剂量-反应关系。照后7 d,四君子汤各剂量组嗜多染红细胞微核数明显低于照射对照组,该作用随四君子汤浓度增加而增强,并有剂量-效应关系,提示四君子汤于照射后7 d可以显著降低受照小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率,对骨髓细胞DNA具有保护作用。此外,结果中还可发现,照射后7 d四君子汤低、中剂量组小鼠的嗜多染红细胞数与阴性对照小鼠的比较,差异无统计学意义,而高剂量组的嗜多染红细胞微核数明显低于阴性对照小鼠的微核数(t=3.247,P < 0.05,表1)。

3. 四君子汤对受照小鼠脾细胞凋亡的影响:小鼠受3.5 Gy照射后3 d,与阴性对照组相比,照射对照组小鼠的脾细胞早期凋亡率增加(t=-7.149,P < 0.05);与照射对照组比较,四君子汤各剂量脾细胞早期凋亡率及总凋亡率均呈下降趋势,其中低剂量组和中剂量组与照射对照组比较,差异有统计学意义(t=3.161、4.143、2.259、2.423,P < 0.05)。受照后7 d,与阴性对照组比较,照射对照组小鼠的脾细胞早期、晚期及总凋亡率均提高,其中晚期凋亡率与阴性对照组比较,差异有统计学意义(t=3.161、4.143,P < 0.05);照后7 d,四君子汤中剂量组与照射对照组相比,脾细胞早期、晚期及总凋亡率降低明显(t=2.251、2.413、2.385,P < 0.05)。表明四君子汤对于辐射损伤小鼠的脾细胞凋亡有一定的抑制作用,中剂量组抑制脾细胞凋亡作用明显(表2)。

表 2()

表 2 四君子汤对3.5 Gy照后不同时间小鼠脾细胞凋亡率的影响(%, ± s)

表 2 四君子汤对3.5 Gy照后不同时间小鼠脾细胞凋亡率的影响(%, ± s)

淋巴系统和造血系统对电离辐射最为敏感。淋巴母细胞由骨髓造血干细胞发育而来,成熟后可由外周血迁出,进入脾小结、脾索等部位,分化增殖为浆细胞,合成抗体,发挥体液免疫功能。脾脏是唯一位于血液循环通路上的周围淋巴器官,也是淋巴母细胞成熟后分布的主要器官,与造血和免疫应答均关系密切,属于电离辐射高度敏感器官。辐射后1~2 d脾脏体积缩小和重量减轻,脾内T细胞和B细胞数迅速减少,淋巴细胞发生凋亡^[11]。因此,提高淋巴细胞活力,减轻脾脏细胞凋亡是抗电离辐射损伤的一种重要策略。本实验发现四君子汤可有效抑制3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射小鼠的脾脏重量降低,减少脾细胞凋亡,提示四君子汤可能通过抑制脾脏细胞的凋亡,促进脾脏细胞增殖来提高脾脏重量,从而减轻电离辐射所致的损伤,调节免疫和造血功能。

嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段,此时主核已排出,由于无核,极易观察到微核。骨髓嗜多染红细胞微核数增多是骨髓损伤的表现之一,与电离辐射具有明显的剂量-效应关系,可作为评价放射损伤作用的指标之一^{[1, 12]}。本研究结果表明,四君子汤可剂量依赖性降低照射后7 d小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率。这可能与四君子汤减轻脾细胞电离辐射损伤、保护脾脏功能密切相关。机体受到电离辐射后处于病理条件下,骨髓造血功能减弱;作为髓外造血的发生地,若脾脏仍能维持正常功能,则可在脾索内生成吞噬细胞,进入外周血循环中,进而游走至骨内的滋养血管,从而去除骨髓内新生红细胞中的DNA残片和残余细胞核等包涵物^[11],减少骨髓内嗜多染红细胞微核数。

综上,本研究以造血免疫器官脾脏和骨髓微核为观察对象,所得结果显示,四君子汤对小鼠免疫系统和骨髓细胞具有一定的保护作用。当然,这种保护作用的机制及四君子汤抗辐射活性部位和化学成分分析,均有待更深层次的研究。