中华放射医学与防护杂志  2015, Vol. 35 Issue (11): 801-804   PDF    
引用本文
谢开红, 胡小毛, 刘平平, 郑力, 朱锦灿, 刘善淘, 何冬梅, 刘革修. miR-155在淋巴瘤Raji细胞辐射抵抗中作用的研究[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2015, 35(11): 801-804, DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2015.11.001.
miR-155在淋巴瘤Raji细胞辐射抵抗中作用的研究
谢开红1, 胡小毛1, 刘平平2, 郑力2, 朱锦灿3, 刘善淘3, 何冬梅3, 刘革修3     
1. 423000 郴州, 湘南学院附属医院肿瘤科;
2. 清华大学第一附属医院血液肿瘤科;
3. 暨南大学医学院血液病研究所
收稿日期: 2015-05-23
基金项目: 国家自然基金(81270568)
通信作者: 刘革修, E-mail:tliugx@jnu.edu.cn
[摘要]    目的 研究miR-155在淋巴瘤Raji细胞辐射抵抗中的作用及其机制。方法 实时定量聚合酶链反应检测Raji细胞miR-155的表达,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测PTEN和p-AKT的表达。结果 miR-155 RNA和p-AKT蛋白在Raji细胞中表达较高,而pten基因mRNA和蛋白质表达水平极低,单纯4.0 Gy照射48 h后Raji细胞凋亡率较低;miR-155 siRNA不仅使miR-155 RNA和p-AKT表达水平明显下降,而且pten基因mRNA和蛋白质水平显著增高,同时细胞显示出增殖抑制作用,显著增加Raji细胞对该辐射剂量敏感性,siRNA+射线照射组细胞凋亡率为(36.78±1.35)%,高于单纯照射组(t=12.572,P<0.05)。结论 miR-155 表达对Raji细胞辐射敏感性具有重要影响,其机制与PTEN/PI3K/AKT信号途径激活有关。
[关键词]     miR-155    Burkitt淋巴瘤    辐射    
Role of miR-155 in radioresistance of lymphoma Raji cells
Xie Kaihong1, Hu Xiaomao1, Liu Pingping2, Zheng Li2, Zhu Jincan3, Liu Shantao3, He Dongmei3, Liu Gexiu3     
Departerment of Oncology, Affiliated Hospital of XiangNan University, Chenzhou 423000, China
[Abstract]    Objective To investigate the role of miR-155 in radio-resistance of lymphoma cell line Raji cells.Methods The expression of miR-155 was detected by quantitative real-time PCR, cell growth was detected by CCK-8 assay, cell apoptosis was detected by flow cytometry, and the protein expressions of PTEN and p-AKT were detected by Western blot. Results The Raji cells had high levels of miR-155 RNA and p-AKT protein had a very low level of PTEN protein. Cell apoptosis was induced by 4.0 Gy X-ray irradiation after 48 h. The transfection of cells with miR-155 siRNA not only silenced miR-155, but also significantly decreased p-AKT level, increased the expression of pten gene and protein level, inhibited cell proliferation, and increased the radiation sensitivity of Raji cell, the apoptosis rate of siRNA+ irradiation group(36.78%±1.35%) was higher than that of irradiation group(t=12.572,P<0.05).Conclusions High levels of miR-155 was involved in radiation resistance of lymphoma Raji cells and this activity is likely modulated by the PTEN/PI3K/AKT signaling pathway.
[Key words]     miR-155    Burkitt lymphoma    Radiation    

Burkitt 淋巴瘤是一种高度恶性的非霍奇金淋巴瘤,化疗是其主要治疗方案。但是辅以利妥昔单克隆抗体、手术及局部放疗等辅助治疗措施则可以进一步提高临床治疗效果。局部放疗在Burkitt淋巴瘤治疗中具有一定辅助治疗价值,但是存在并发症,即大剂量辐射对正常组织细胞的损伤。所以,研究Burkitt淋巴瘤放疗敏感性因素对其临床局部放疗具有积极意义。最近,研究发现miR-155在肿瘤细胞中具有抑制细胞凋亡作用,而且其在多种淋巴瘤中高表达,且预后较差[1, 2, 3, 4, 5, 6]。本研究将通过观察miR-155在淋巴瘤Raji细胞辐射抵抗中作用及其机制,为临床Burkitt 淋巴瘤局部放疗研究提供基础依据。

材料与方法

1. 主要试剂和细胞培养:LipofectaminTM2000(美国Invitrogen公司);miR-155-siRNA由上海吉玛公司设计及合成;miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司);CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所);Annexin-V/PI双染试剂盒(上海碧云天生物技术研究所);RPMI 1640培养基、胎牛血清(美国GIBCO公司);Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞由本实验室保存。 Raji细胞冻存复苏后以含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养,置于5%CO2、饱和湿度、37℃孵育箱。

2. CCK-8法检测细胞增殖活性: 实验分空白对照组(CON)、溶媒对照组(MC)、单纯照射组(IC)、siRNA组(siRNA,浓度0.01、0.1、1.0和10.0 μmol/L)和siRNA+照射组(sIC,siRNA浓度1.0 μmol/L)。siRNA转染根据LipofectamineTM 2000试剂盒操作说明进行;IC和sIC组细胞采用德国Simens Primart电子直线加速器产生的6 MeV X射线照射细胞(在25 cm2培养瓶中处理后加入相应组),剂量率为 1.53 Gy/min,放射源至细胞的距离为100 cm,照射野为25 cm×25 cm,总剂量为4.0 Gy,参考文献[7]。取对数生长期细胞200 μl接种于96孔板中(密度2×104/ml),置于5%CO2、饱和湿度、37℃孵育箱中培养,48 h时进行CCK-8检测,计算增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-siRNA组A450/溶媒对照组A450)×100%,实验重复3次。

3. 实时定量聚合酶链反应(RQ- PCR)检测目标基因表达:取对数生长期细胞以5×104 /ml密度接种于6孔板中,每孔2 000 μl,以1.0 μmol/L siRNA转染干预,24 h后,收集细胞,使用miRcute miRNA分离试剂盒提取miRNA,经纯度及电泳检测后,根据miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒操作说明合成cDNA第一链,采用实时荧光定量PCR 法检测miR-155 RNA表达,以GAPDH为内参,采用2-△△ CT法计算miR-155相对表达量。GAPDH上游引物为5' GGATTTGGTCGTATTGGG 3';下游引物为5' GTGGCTGGGGCTCTACTTC 3';miR-155 RNA上游引物为5' GCGGTTAATGCTAATCGTGAT 3';下游引物为5' GTGCAGGGTCCGAGGT 3'; PTEN 上游引物为 5' GCTATGGGATTTCCTGCAGAA 3',下游引物为5' GGCGGTGTCATAATGTCTTTCA 3'。

4. Annexin V-PI 双染检测细胞凋亡:收集处理48 h后细胞,加入195 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞,加入5 μl Annexin V-FITC室温避光孵育10 min,离心(500× g,5 min)弃上清,加Annexin V-FITC结合液190 μl重悬细胞,加PI染色液10 μl避光冰浴,流式细胞仪检测。

5. Western blot检测: miR-155 siRNA处理48 h后,收集细胞、PBS洗2遍,加蛋白抽提液提取总蛋白,测定蛋白浓度,10% SDS-PAGE电泳及转PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭1 h。PTEN、GAPDH及p-AKT抗体 4℃过夜,HRP标记二抗室温孵育1 h,以TBST洗3次,ECL显色液发光、成像。

6. 统计学处理:采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,实验数据中计量资料以 ± s表示,多组间数据各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间的比较采用SNK或Tukey检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. miR-155 siRNA 对Raji细胞增殖及其辐射敏感性的影响:CCK-8结果显示,miR-155 siRNA在0.01 μmol/L时作用不明显,0.1~10.0 μmol/L处理Raji细胞48 h后,细胞的增殖均受到抑制,但各浓度之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。流式细胞术结果显示,4.0 Gy X射线照射后48 h,单纯照射组Raji细胞凋亡率为(6.24±0.93 )%,1.0 μmol/L miR-155 siRNA处理组细胞凋亡率为(5.69±0.94 )%,而siRNA+射线照射组细胞凋亡率为(36.78±1.35 )%,高于单纯照射组,差异有统计学意义(t=12.572,P < 0.01),见图1。

图 1 miR-155siRNA与4.0 Gy辐射对Raji细胞凋亡的影响 Annexin V-PI 双染检测细胞凋亡的流式细胞散点图:B1为机械损伤细胞部分,B2为晚期凋亡细胞部分,B3为正常细胞,B4为早期凋亡部分。 A.空白对照组;B.单纯照射组;C.1.0 μmol/L miR-155 siRNA处理组;D.1.0 μmol/L miR-155 siRNA+射线照射组

2. miR-155 siRNA 对Raji细胞中PTEN和AKT表达水平的影响:qRT-PCR检测显示(表1),正常培养的Raji细胞表达有miR-155 mRNA,其表达量与GAPDH mRNA量比值为(0.775±0.033),pten mRNA表达水平较低,其表达量与GAPDH mRNA量比值为(0.121±0.031);Western blot检测显示(图2),Raji细胞中PTEN表达水平较低、而p-AKT表达水平较高。miR-155 siRNA处理不仅使miR-155 mRNA表达水平显著下降(t=33.834,P < 0.05),而且出现pten mRNA(t=9.182,P < 0.05)和蛋白升高(t=7.080,P < 0.05),p-AKT表达水平下降,与溶媒对照组相比,差异有统计学意义(t=7.915,P < 0.05)。

表 1 siRNA处理Raji细胞前后基因和蛋白表达变化

图 2 miR-155 siRNA 对Raji细胞中PTEN和p-AKT表达水平的影响 CON.空白对照组;MC.溶媒对照组;siRNA.miR-155 siRNA处理组
讨 论

越来越多的研究发现,miRNA异常表达可改变淋巴细胞生长发育、存活与凋亡命运,从而导致淋巴瘤发生发展[8, 9, 10],而且与肿瘤细胞放化疗敏感性具有密切关系[11, 12]。miR-155是21号染色体上B细胞整合簇(BIC)基因上的非编码RNA转录产物,正常情况下具有促进淋巴细胞发育分化作用,异常高表达则直接或间接地降低具有促进凋亡功能蛋白的合成。研究发现,miR-155在一些B细胞淋巴瘤,包括小儿Burkitt淋巴瘤、弥漫大B细胞性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤和霍奇金病(HL)中异常高表达,而且miR-155高表达的活化B细胞型弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)预后比低表达的生发中心型DLBCL的较差[13, 14]。Yamanaka等[15]研究发现,高表达miR-155可导致自然杀伤细胞淋巴瘤pten等表达水平下降、AKT(ser473)高磷酸化,抑制miR-155表达则pten等表达水平升高,AKT(ser473)磷酸化下调。pten基因是一种极其重要的肿瘤抑制基因,PTEN蛋白是肿瘤抑制因子蛋白,具有脂质和蛋白双重磷酸酶活性,在细胞生长、生存与凋亡等方面发挥重要作用。在正常情况中,pten则可利用磷酸酶活性使PIP3脱磷酸形成丧失信使功能的PIP2,从而抑制PI3K/AKT信号通路。相反,pten表达下调、突变或缺失,则细胞内PIP3积聚、AKT持续活化,从而抑制细胞凋亡,促进细胞生长,导致肿瘤的发生发展。研究表明 PTEN/ PI3K/AKT 信号通路广泛存在于各种肿瘤细胞中,促进细胞周期进展,与肿瘤细胞的增殖与凋亡、侵袭转移及耐药等密切相关[16, 17]。

本研究通过应用miR-155 siRNA和辐射单独及联合作用于Burkitt淋巴瘤Raji细胞,观察miR-155 siRNA能否增强辐射对Raji细胞的增殖凋亡作用。研究结果显示,miR-155 siRNA不仅抑制Raji细胞的miR-155表达、影响PTEN/PI3K/AKT信号通路Akt磷酸化,而且抑制细胞增殖、并显著增强辐射诱导的凋亡作用。本研究结果不仅表明miR-155 表达对Raji细胞中PTEN和AKT表达水平具有重要影响,而且证实,miR-155 表达对Raji细胞辐射敏感性具有重要影响。其机制与PTEN/PI3K/AKT信号途径激活有关。该结果对临床Burkitt 淋巴瘤放疗具有积极意义。

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