放射治疗是食管癌治疗的主要方法之一，但单纯放疗疗效较差，这与食管癌细胞的放射抗拒密切相关。环氧合酶(cyclooxygenase,Cox)[JP]是细胞代谢的主要限速酶。细胞水平证实，下调Cox-2表达可以提高食管癌EC9706细胞的辐射敏感性^[1]，但在活体水平是否如此仍需进一步验证。本研究通过构建裸鼠移植瘤模型观察调控Cox-2基因表达对食管癌EC9706细胞放射敏感性的影响，为Cox-2基因作为预测食管癌放疗疗效的评价指标提供实验依据。

1. 细胞系与主要试剂：人食管癌细胞系EC9706由郑州大学基础医学院病理生理学教研室提供；siRNA表达载体pRNA-U6.1、siRNA无关序列对照质粒(pRNAT-U6.1-Con)购自美国GenScript公司；真核表达载体pcDNA^®4/HisMax C 购自美国Invitrogen公司。

2. 实验动物与分组：SPF级纯品系BALB/c雄性裸小鼠25只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，4～6周龄，体重15.2～18.5 g。动物合格证号：SCXK(京)2011-0006。细胞共分5组：Cox-2上调组、Cox-2下调组、无关siRNA对照组、载体对照组、空白对照组。Cox-2上调组为转染pcDNA^®4-Cox-2的EC9706细胞，Cox-2下调组为稳定转染pRNA-U6.1-sicox214的EC9706细胞，无关siRNA对照组为稳定转染pRNA-U6.1-Con的EC9706细胞；载体对照组为稳定转染pcDNA^®4/HisMax C的EC9706细胞。空白对照组为未经转染的EC9706细胞。裸鼠依据随机数字表分5组，每组5只，分别接种稳定转染的Cox-2上调组、Cox-2下调组、无关siRNA对照组、载体对照组、空白对照组细胞。

3. RT-PCR检测各组细胞Cox-2 mRNA的表达：用德国Qiagen公司的小量总RNA提取试剂盒提取各组细胞的mRNA，采用TaqMan探针荧光检测法，以β-肌动蛋白为内参照，分别检测细胞Cox-2 mRNA表达水平。Cox-2的引物和探针序列上游为5′ AATTCCAGTACCAAAATCGTATTGC 3′，下游为5′ ACTGTTGATAGTTGTATTTCTGGTCATGA 3′，探针为FAM-5′ TTTAACACCCTCTATCACTGGCATCCCCTT-TAMMR 3′。

4. Western blot检测蛋白表达：参照文献^[2]方法，收集各组细胞，制备细胞总蛋白进行十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。用电转移的方法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，以Cox-2蛋白抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体为二抗检测Cox-2蛋白的表达。

5. 建立EC9706细胞系裸鼠移植瘤模型：分别在裸鼠的颈部皮下注射0.2 ml各组稳定转染的EC9706细胞悬液。隔天观察裸鼠的成瘤情况，注射后15 ｄ，用游标卡尺测量肿瘤的长短径，并记录。

6. 裸鼠照射：接种3周后开始照射。使用专用小鼠体位固定架固定四肢和头部，使用德国西门子直线加速器6 MV X射线，照射野2 cm×2 cm，源皮距(SSD) 100 cm，吸收剂量率200 cGy/min，2 Gy/次，1次/d，5次/周，总剂量20 Gy。瘤体表面垫2 cm的固体水作为补偿，以提高瘤体的百分深度剂量。

7. 观察肿瘤放疗反应：照射期间隔天观察皮下移植瘤的放疗反应。照射结束后3 d处死裸鼠，剥取肿瘤，光电天平称重(G)，按下列公式计算肿瘤体积(V)和抑瘤率：肿瘤体积=L(长径)×l(短径)²×0.52^[3]；抑瘤率(%)=(V_对照组-V_实验组)/V_对照组×100%，[JP]或抑瘤率(%)=(G_对照组-G_实验组)/G_对照组×100%。

8. 统计学处理：数据用±s表示。采用SPSS 13.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

1. Cox-2 siRNA载体构建结果：si214-F和si214-R发卡样DNA寡核苷酸单链，退火形成的DNA双链产物电泳可见明亮条带，位于接近100 bp处，与设计一致(图1)；退火产物与线性双黏siRNA载体pRNA-U6.1连接，转化后得到多个阳性转化菌，随机选取1株提取质粒，对插入序列测序，结果与设计序列完全一致，得到pRNA-U6.1-sicox214。

图1()

图1 针对Cox-2基因siRNA发卡DNA的退火电泳结果 注：1.si214-F和si214-R发卡样单链DNA退火产物；M.Marker

2. Cox-2表达载体的构建结果：PCR扩增产物电泳，256 nm紫外灯下观察，可见1 815 bp的条带，与Cox-2基因ORF长度一致(图2)。将重组子pcDNA^®4-Cox-2的测得序列用生物学软件与GenBank中Cox-2序列进行同源性比较分析，结果显示插入序列与GenBank中Cox-2序列完全一致。

图2()

图2 Cox-2表达载体的PCR扩增产物电泳结果 注：1.目的基因Cox-2的PCR扩增条带；2、3均为 重组子pcDNA®4-Cox-2的扩增条带；M.Marker

3. RT-PCR检测结果：结果列于表1。由表1可知，空白对照组与无关siRNA对照组、载体对照组细胞Cox-2 mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义。Cox-2下调组与各对照组相比显著降低(F=546.43，P＜0.05)，说明构建的siRNA载体转染EC9706细胞后，能抑制细胞Cox-2 mRNA的表达；Cox-2上调组与各对照组相比显著升高(F=873.65，P＜0.05)，说明构建Cox-2表达载体转染EC9706细胞后，能高效表达Cox-2 mRNA。

表1()

表1 RT-PCR检测各组细胞Cox-2 mRNA相对表达量(±s)

表1 RT-PCR检测各组细胞Cox-2 mRNA相对表达量(±s)

4. Western blot检测：空白对照组、无关siRNA对照组、载体对照组细胞均有较强的Cox-2免疫印迹条带；Cox-2下调组免疫印迹条带显著减弱，Cox-2上调组免疫印迹最强(图3)。说明构建Cox-2表达载体转染EC9706细胞后，能高效表达Cox-2 mRNA和蛋白。

图3()

图3 Western blot检测各组细胞Cox-2蛋白表达结果 注：1.Cox-2下调组；2.无关siRNA对照组；3.Cox-2上调组；4.载体对照组；5.空白对照组

5. 皮下种植瘤的生长情况：接种后1周，裸鼠颈部皮下见新生肿瘤结节，2～3周时增至(5～10)mm×(5～10)mm，不同组别荷瘤小鼠肿瘤结节大小有差异。25只裸鼠皮下种植肿瘤成瘤率为100%，无自然死亡，各组之间成瘤率无明显差异。接种后3周，测量瘤体的长径和短径，结果列于表2。由表2可知，与空白对照组、siRNA对照组及载体对照组相比，Cox-2下调组裸鼠皮下种植瘤平均体积偏小(F=34.26，P＜0.05)；而Cox-2上调组裸鼠皮下种植瘤平均体积明显偏大，差异有统计学意义(F=26.38，P＜0.05)。

表2()

表2 接种3周后不同处理组间皮下种植瘤体积

表2 接种3周后不同处理组间皮下种植瘤体积

观察裸鼠的照射反应发现，吸收剂量为2～4 Gy时，皮下种植瘤明显增大，考虑为照射后局部组织水肿所致。随后，随着照射剂量的增加，肿瘤缩小明显。照射结束解剖裸鼠可见肿瘤组织为灰白色或淡红色，表面呈结节状，触及质地较硬。照射结束测量瘤体的长径和短径，结果列于表3。由表3可知，空白对照组、载体对照组、无关siRNA对照组和Cox-2下调组瘤体平均体积较照射前均减小(t=2.67、2.89、3.36、2.76，P＜0.05)，其中Cox-2下调组减小最为明显(F=16.35，P＜0.05)，而Cox-2上调组裸小鼠皮下种植瘤平均体积较照射前无明显变化。

表3()

表3 各组移植瘤开始照射后不同时间平均体积的变化(mm3,±s)

表3 各组移植瘤开始照射后不同时间平均体积的变化(mm3,±s)

6. 各实验组裸鼠移植瘤剥离后称重：Cox-2下调组、空白对照组、无关siRNA对照组和载体对照组瘤体质量分别为(0.612±0.061)、(0.997±0.045)、(1.007±0.092)和(1.015±0.087)g，Cox-2下调组与其他对照组比较，显著减低(F=6.89，P＜0.05)；Cox-2上调组瘤体质量为(1.314±0.105)g，与其他对照组相比，明显增高(F=17.53，P＜0.05)。

Cox是前列腺素合成过程中一个主要限速酶，参与多种疾病的病理生理过程。相关研究显示，Cox-2在食管癌等多种肿瘤组织中呈高表达，参与肿瘤的发生、发展，且与恶性肿瘤的侵袭转移相关性密切^{[4, 5]}。有研究提示，Cox-2可通过参与致癌物代谢，引起细胞增殖和凋亡失衡，促进肿瘤血管生成，增加肿瘤的浸润和转移能力^[6]，使机体免疫功能受到抑制^[7]。

本实验通过观察食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤模型生长情况，发现25只裸鼠皮下种植肿瘤成瘤率为100%，无自然死亡，各组之间成瘤率差异无统计学意义，提示转染Cox-2 siRNA并没有影响食管癌EC9706细胞的成瘤性。此外，Cox-2下调组裸鼠皮下种植瘤平均体积与对照组相比较小，而Cox-2上调组裸鼠皮下种植瘤平均体积明显大于对照组。由此证实Cox-2高表达时肿瘤的生长及侵袭能力较强，肿瘤生长较快，Cox-2低表达时肿瘤的生长及侵袭能力相对较弱，肿瘤生长相对缓慢。Cox-2表达水平可作为评估肿瘤对放疗是否抵抗的一个指标^{[8, 9]}。如在脑胶质细胞瘤中，放射抗拒的细胞中Cox-2表达水平是放射敏感者的1.7倍^[6]，放射抗拒性越强，Cox-2在肿瘤组织中的表达水平越高^{[8, 10]}。研究表明，下调Cox-2表达可以提高肿瘤细胞放射敏感性，其机制可能是下调细胞内Cox-2表达，继而下调MMP2和Bcl-2，上调Bax表达，导致肿瘤细胞的侵袭及转移能力降低，诱导细胞凋亡^[1]。为观察调控Cox-2基因表达对食管癌放疗敏感性的影响，本实验以瘤体放疗前后体积的变化和放疗后瘤体质量作为评价指标，结果显示，Cox-2下调组瘤体体积减小幅度明显高于空白对照组、载体对照组、无关siRNA对照组。而Cox-2上调组瘤体体积减小幅度明显低于对照组。放疗后Cox-2下调组瘤体质量明显低于空白对照组、载体对照组、以及无关siRNA对照组，Cox-2上调组瘤体质量明显高于对照组，说明下调Cox-2表达确实对食管癌移植瘤具有放射增敏作用，而上调Cox-2表达则使肿瘤放射抗拒。

由此认为，下调Cox-2基因表达与X射线照射联合治疗具有协同增强的抗肿瘤作用，抑制了肿瘤细胞对放射损伤的修复能力，从而增加了肿瘤对放射线的敏感性。因此，低表达Cox-2的肿瘤放射治疗效果较好，而高表达Cox-2的肿瘤则会放射抗拒，放射治疗效果较差。