中华放射医学与防护杂志  2015, Vol. 35 Issue (10): 730-733   PDF    
引用本文
魏威, 陈海燕, 邵立虹, 史涛, 高辉, 董卓, 金霖霖, 赵刚, 申延男, 金顺子. 电离辐射对小鼠胸腺Th17细胞相关细胞因子的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2015, 35(10): 730-733, DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2015.10.003.
电离辐射对小鼠胸腺Th17细胞相关细胞因子的影响
魏威1, 陈海燕2, 邵立虹1, 史涛3, 高辉1, 董卓1, 金霖霖1, 赵刚1, 申延男1, 金顺子1     
1. 130021 长春, 吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室;
2. 吉林大学第一医院;
3. 佳木斯大学附属第一医院
收稿日期: 2015-04-25
基金项目： 国家自然科学基金(30870584, 81371890)
通信作者：金顺子,Email: jinsz@jlu.edu.cn
[摘要]    目的 通过研究电离辐射对小鼠胸腺Th17细胞相关细胞因子的影响,探讨高、低剂量辐射诱导不同的免疫效应中Th17细胞功能。方法 将健康ICR小鼠按随机数字表法分为健康对照组、低剂量照射组(0.05、0.075 Gy)和高剂量照射组(0.5、1.0、2.0、4.0 Gy)探讨剂量-效应关系,用X射线深部治疗机进行不同剂量的全身照射,于照射后24 h处死。同时,探讨时间-效应关系,即分为健康对照组、低剂量照射组(0.075 Gy)和高剂量照射组(2.0 Gy),于照射后12、24、48 h处死,取胸腺组织制备成组织匀浆,ELISA法检测小鼠胸腺细胞中白介素-17a(IL-17a)与白介素-21(IL-21)的浓度。结果 在时间-效应结果中,与健康对照组相比,0.075 Gy照射组胸腺细胞IL-17a和IL-21分泌量呈下降趋势,其分泌量于48 h降到最低(t=3.85、4.73,P<0.05);而2.0 Gy照射组均呈大幅度上升趋势,其分泌量在48 h达到最高(t=-6.74、-6.19,P<0.05);在剂量-效应结果中,与健康对照组相比,较低剂量照射组胸腺细胞IL-17a与IL-21分泌量下降,在0.05 Gy最低(t=8.39、16.45,P<0.05);较高剂量照射组胸腺细胞的分泌量上升,在4.0 Gy时升至最高(t=-15.60、-18.62,P<0.05)。结论 高剂量辐射可以诱导小鼠胸腺细胞IL-17a与IL-21分泌量的增加,而低剂量辐射使其下降,表明Th17细胞相关的细胞因子在低剂量辐射诱导的免疫功能增强效应和高剂量辐射诱导免疫抑制效应中起着重要的作用。
[关键词]     电离辐射    Th17细胞    细胞因子    免疫功能    
Effect of ionizing radiation on the cytokines of mouse thymus Th17 cells
Wei Wei1, Chen Haiyan2, Shao Lihong1, Shi Tao3, Gao Hui1, Dong Zhuo1, Jin Linlin1, Zhao Gang1, Shen Yannan1, Jin Shunzi1     
College of Public Medicine, Key Laboratory of Radiobiology, Ministry of Health, Jilin University, Changchun 130021, China
[Abstract]    Objective To study the cytokine releases in the thymus Th17 cells of irradiated mice, and to explore the function of Th17 cells in different immune responses to radiation of different doses. Methods According to the random number table method, ICR mice were divided into three groups i.e., healthy control group, low-dose group (0.05, 0.075 Gy) and high-dose group (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 Gy) to explore the dose-effect relationship. In the dose-effect group, the ICR mice exposed to different dosages of whole body X-ray irradition were decapitated at 24 h after irradiation. Meanwhile, ICR mice were divided into three groups i.e., healthy control group, low-dose group (0.075 Gy) and high-dose group (2.0 Gy) to explore the time-effect relationship. The mice were decapitated after 12, 24, and 48 h of 0.075 and 2 Gy of whole body X-ray irradiation, then prepared for the thymus tissue homogenization. The expressions of IL-17a and IL-21 in the thymus tissue homogenization were detected by ELISA. ResultsFor the time-effect, following a low dose irradiation of 0.075 Gy, the levels of IL-17a and IL-21 in the thymocytes continuously decreased along with the time post-irradiation and reached its lowest value at 48 h after radiation but it was still higher than that in the control group (t=3.85, 4.73, P<0.05); the expressions of these cytokines dramatically increased along with the time post-irradiation and reached to its highest level at 48 h after irradiation of 2.0 Gy (t=-6.74, -6.19, P<0.05). For the dose-effect group, at 24 h after irradiation, the expressions of IL-17a and IL-21 in mouse thymocytes were lower than controls for low dose groups and had the lowest level at 0.05 Gy(t=8.39, 16.45, P<0.05), while they increased in the high dose groups and had the highest level at 4.0 Gy(t=-15.60, -18.62, P<0.05). Conclusions After irradiation, the secretions of IL-17a and IL-21 in mouse thymocytes are inhibited by low dose irradiation but triggered by higher doses, which indicates that Th17-related cytokines play an important role in immune suppression induced by a high dose radiation, while the immune function enhancement is induced by low dose radiation.
[Key words]     Ionizing Radiation    Th17 cells    Cytokines    Immune function    

细胞因子是免疫细胞与基质细胞之间对话交流的媒介。辅助性T 细胞17(Th17)是新发现的一种T淋巴细胞亚群，参与先天性免疫和获得性免疫反应，其主要通过分泌IL-17细胞因子诱导白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等多种炎症因子高表达，被认为是一群重要的介导炎症反应的细胞[1, 2, 3]。转化生长因子β(TGF-β)、IL-6、IL-23及IL-21在Th17细胞的分化形成过程中起着积极的促进作用。因此，研究不同剂量电离辐射对小鼠免疫细胞Th17细胞相关细胞因子的影响，有助于阐明高、低剂量电离辐射诱导的免疫功能机制。本实验通过检测高、低剂量辐射全身照射的小鼠胸腺细胞IL-17a与IL-21的分泌量的时间-效应和剂量-效应变化，探讨高、低剂量辐射诱导的免疫效应中Th17细胞功能。

材料与方法

1. 实验动物：健康ICR小鼠雌、雄各半，体重18～22 g，购于吉林大学基础医学院实验动物中心，许可证编号SCXK(吉)2013-0001。在时间-效应实验中，将ICR小鼠按随机数字表法分为健康对照组、低剂量照射组(0.075 Gy)和高剂量照射组(2.0 Gy)，低剂量照射组和高剂量照射组又分别分为12、24、48 h组，每组6只，于照射后12、24、48 h断头处死小鼠取胸腺组织；在剂量-效应实验中，将ICR小鼠按随机数字表法分为健康对照组、0.05、0.075、0.5、1.0、2.0、4.0 Gy组，每组6只，于照后24 h断头处死小鼠取胸腺组织。

2. 照射条件：国产X.S.S.205(FZ)型固定式X射线深部治疗机(辽宁丹东市康嘉仪器设备有限公司)，单次剂量0.5～4.0 Gy，源靶距60 cm，吸收剂量率0.343 Gy/min；单次剂量0.05～0.075 Gy，源靶距178.50 cm，吸收剂量率11.9 mGy/min。

3. 样品处理：取每只小鼠的胸腺组织1 g，在冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，放入10 ml的小烧杯中，用移液管量取预冷的0.86%生理盐水，溶剂体积比为1∶9，尽快剪碎组织块，用玻璃匀浆器进行粉碎，取10%匀浆用低温离心机1 500 r/min，离心半径11.5 cm，离心10～15 min后，留取上清-80℃保存备用。

4. IL-17a与IL-21分泌量的检测：按照ELISA试剂盒操作方法(鼠IL-17a和IL-21购于美国Biotechnology公司)，取组织匀浆上清液100 μl加入到平底酶标板中，每组设有3个平行样，用ELx800自动酶联免疫标记仪(美国BioTek公司)，450 nm处检测吸光度(A)值。根据标准品绘制标准曲线，求出所测样品的相应浓度。

5. 统计学处理：数据以±s表示，采用SPSS 17.0软件进行分析。IL-17a与IL-21分泌量数据进行ANOVA方差分析和独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. 小鼠胸腺细胞IL-17a和IL-21分泌量的时-效变化：X射线照射不同时间后小鼠胸腺细胞两种细胞相关因子表达的时-效变化结果列于表1。由表1可知，与健康对照组相比，0.075 Gy X射线照射后IL-17a的分泌量呈下降趋势，并于48 h降至最低(t=3.85，P＜0.05)；而在2.0 Gy X射线照射后其分泌量随时间逐渐增多，至48 h达最高(t=-6.74，P＜0.05)。0.075 Gy X射线照射后IL-21的分泌量呈下降趋势，并于48 h降至最低(t=4.73，P＜0.05)；而在2.0 Gy照射后分泌量随时间上升，并于24 h达到最高水平，到48 h后仍处于高水平(t=-10.38、-6.19，P＜0.05)。

表1 X射线照射不同时间后小鼠胸腺细胞IL-17a和 IL-21表达的时-效变化(%，±s)

2. 小鼠胸腺分泌IL-17a与IL-21浓度的量-效变化： X射线不同剂量照射后小鼠胸腺细胞两种细胞相关因子表达的量-效变化结果列于表2。由表2可知，与健康对照组相比，低剂量(0.05和0.075 Gy)全身照射后，胸腺中IL-17a的表达均降低，在0.05 Gy时达到最低(t=8.39，P＜0.05)；而较高剂量(0.5、1、2和4 Gy)全身照射后IL-17a的表达呈剂量依赖性上升趋势，于4.0 Gy时达峰值(t=-15.60，P＜0.05)。IL-21表达的量-效变化与IL-17a的趋势相近，在0.05 Gy降至最低(t=16.45，P＜0.05)；而较高剂量全身照射后逐渐呈剂量依赖性上升趋势，并于4.0 Gy处升至最高(t=-18.62，P＜0.05)，超过健康对照组水平的4.5倍。

表2 X射线不同剂量照射后小鼠胸腺细胞IL-17a与 IL-21表达的量-效变化(%，±s)
讨 论

近代免疫学理论认为，根据细胞的分化和功能将CD4+T细胞分为1型和2型辅助性T细胞(Th)和调节性T细胞(Treg)[4]。2005年发现新型效应性Th细胞亚群—Th17细胞，发现Th17细胞由TGF-β、IL-1、IL-6、IL-21、IL-23所诱导，并分泌大量的IL-17a、IL-17f、和IL-22，在组织炎症和自身免疫疾病发生的过程中起到重要作用。

IL-17是一种由活化的T细胞产生的致炎细胞因子，可以促进T细胞的激活并刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子，从而导致炎症的产生[5, 6]。Th17的分化通过TGF-β和IL-6的共同作用来启动；新分化的Th17细胞通过其分泌的IL-21促进Th17的扩增，最后，Th17细胞特征的稳定和维持是通过IL-23实现的。IL-6是一个致炎性因子，感染或局部炎症能产生大量的IL-6和TGF-β，可抑制巨噬细胞和淋巴细胞等细胞的免疫功能，发挥免疫负调控作用，从而能够维持免疫耐受的稳定状态[7]。本实验中，较高剂量辐射诱导的IL-17a增多，其变化出现时间和剂量依赖现象，可能与TGF-β分泌增多有关，高剂量电离辐射可使小鼠免疫细胞TGF-β的表达量上升[8]，可能在TGF-β和IL-6 的共同诱导下分化为Th17[9]，使IL-6和IL-17的表达量升高，进而影响机体免疫功能。而低剂量电离辐射可以使负性调节因子TGF-β的表达量呈下降趋势[10]，并且使正向调节因子γ干扰素(IFN-γ)呈上升趋势[11]，从而使IL-17a分泌量显著下降，提示正向调节的细胞因子分泌的增加和负性调节因子的下降，可能是低剂量辐射兴奋效应的主要原因之一。已有研究发现，IFN-γ可通过抑制TGF-β下游信号转导因子Smad3磷酸化，从而阻断Smad3对TGF-β受体的作用，进而干扰TGF-β诱导Th17细胞分化的过程，导致IL-17的分泌量降低，从而发挥免疫效应[12]。

IL-21是IL-2家族成员，由Th17细胞大量分泌，IL-21与TGF-β协同促进Th17细胞的分化。Bettelli等[13]发现，在IL-6缺陷的条件下，TGF-β和IL-21共存可促进CD4+T细胞分化为Th17细胞，并释放IL-21。进一步研究发现，在Th1、Th2细胞IL-21的分泌水平较低，而在Th17细胞IL-21则相反。本实验结果显示，较高剂量照射后小鼠胸腺细胞IL-21分泌量增加，可能在与TGF-β的共同作用下，导致IL-17a的分泌量增加，从而参与诱导机体免疫功能的下降；相反，低剂量辐射对小鼠胸腺细胞分泌IL-21有抑制作用，因为IL-21是Th17的驱动因子，所以低剂量辐射可以抑制Th17的分化形成，从而降低IL-17a的表达。文献报道，较高剂量辐射可以诱导小鼠免疫细胞TGF-β的表达量上升[10]，幼稚Th细胞在TGF-β存在的情况下趋向于表达转录因子Foxp3，从而分化为Treg细胞。在TGF-β和IL-21共同存在的情况下，能抑制TGF-β诱导的Foxp3的表达，从而阻止Treg细胞的分化，使得幼稚T细胞向Th17细胞分化。单独的TGF-β或者IL-21均不能使幼稚T细胞大量产生IL-17a，只有两者同时作用才能引起IL-17a的大量分泌。本实验结果提示，较高剂量电离辐射可能通过增强TGF-β和IL-21的分泌量，共同促进Th17细胞的分化，从而诱导IL-17a的分泌，在抑制机体免疫功能中发挥重要作用。

综上所述，胸腺细胞受到高、低剂量电离辐射作用后，Th17细胞相关的细胞因子IL-17a和IL-21分泌量的变化完全相反，主要表现为低剂量照射后降低，而较高剂量照射后升高，从而为阐明辐射免疫学理论提供理论依据。

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